利用SSR標(biāo)記分析木薯遺傳多樣性

王明++肖鑫輝++安飛飛++萬(wàn)仲卿++應(yīng)東山++王琴飛++張如蓮++李開(kāi)綿++葉劍秋

摘 要 應(yīng)用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記對(duì)國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃195 份國(guó)內(nèi)（外）品種（系）進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：44對(duì)引物共擴(kuò)增出186個(gè)等位基因，每對(duì)引物平均擴(kuò)增出2～8個(gè)等位基因，平均Shannon's信息指數(shù)I為1.01，平均多態(tài)性信息量（PIC）為0.49。195個(gè)品種（系）的遺傳相似系數(shù)（GS）分布在0.57～0.99。聚類分析結(jié)果表明，在遺傳距離0.71處，可將供試材料分為7個(gè)類群。

關(guān)鍵詞 木薯 ；SSR標(biāo)記 ；遺傳多樣性 ；聚類分析

分類號(hào) S533

Genetic Diversity of Cassava Germplasm Revealed by SSR Markers

WANG Ming XIAO Xinhui AN Feifei WAN Zhongqing

YING Dongshan WANG Qinfei ZHANG Rulian LI Kaimian YE Jianqiu

（Tropical Crops Genetic Resources Institute /

Ministry of Agriculture Key Laboratory for Germplasm Resources Conservation

and Utilization of Cassava / Ministry of Agriculture Key Laboratory of

Tropical Crops Germplasm Resources Utilization， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract Using simple sequence repeat （SSR） markers 195 domestic（foreign）varieties（lines） on the National Cassava Germplasm Resources Garden were analyzed for genetic diversity. The results showed that 44 pairs of primers amplified 186 alleles with 2-8 alleles amplified by each pair of primers. The average Shannon 's information index was 1.01， and the average PIC is 0.49. The （GS） distributions on the genetic similarity coefficient of 195 varieties （lines） were 0.57～0.99. Cluster analysis results showed that 195 germplasms can be divided into 7 groups while the genetic distance was 0.71.

Keywords cassava ； SSR marker ； genetic diversity ； cluster analysis

木薯（Manihot esculenta Crantz）又稱樹(shù)薯，是世界三大薯類作物之一。19世紀(jì)20年代引入中國(guó)，原來(lái)作為糧食作物，具有高產(chǎn)、抗逆和塊根淀粉含量高的特點(diǎn)。木薯已經(jīng)被確認(rèn)為中國(guó)“十一五”規(guī)劃中能源發(fā)展戰(zhàn)略重點(diǎn)發(fā)展的生物能源作物之一，是淀粉和酒精加工業(yè)的主要原料[1]。木薯是一種高度雜合的作物，這種雜合性帶來(lái)了豐富的遺傳變異性，為木薯育種提供了良好的選擇機(jī)會(huì)[2]。木薯雜交育種主要是從2個(gè)優(yōu)勢(shì)親本的雜種后代中選出理想的重組類型，需對(duì)大量的F1單株進(jìn)行選育。因此，對(duì)木薯品種（系）的遺傳多樣性進(jìn)行分析，可克服雜交時(shí)親本的盲目組合，客觀、全面地了解當(dāng)前木薯育種的現(xiàn)狀和種質(zhì)基礎(chǔ)，為雜交育種和定向育種提供支撐。

目前，分析木薯遺傳多樣性的分子標(biāo)記主要有SRAP[3-4]、SSR[5-9]、AFLP[10]等方法。SSR分子標(biāo)記具有重復(fù)性高、可靠性強(qiáng)且品種間多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，并已廣泛應(yīng)用于玉米、水稻、大豆等作物的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析和品種鑒定[11-13]。由于木薯為異花授粉植物，且基因型高度雜合，因此，使用具有共顯性特點(diǎn)的SSR標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行品種鑒定比其它作物具有明顯優(yōu)勢(shì)。本研究對(duì)包括國(guó)內(nèi)選育品種、地方品種、品系（育種中間材料）和引進(jìn)國(guó)外品種（系）共195份木薯種質(zhì)行遺傳多樣性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用195份木薯材料均采集于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所-國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃，其材料名稱、類型及來(lái)源見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取

每份材料隨機(jī)選取5株，每株剪取1片小嫩葉，將樣品混勻，帶回實(shí)驗(yàn)室貯存于-20℃冰箱備用。采用CTAB改良法提取葉片的基因組DNA。

1.2.2 標(biāo)記來(lái)源

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的木薯SSR研究結(jié)果[14]，設(shè)計(jì)160對(duì)SSR引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 SSR標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)

SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μL，其中包含10×Buffer（含Mg2+）2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.4 μL、ddH2O 14.6 μL、引物各0.8 μL、Taq酶0.4 μL、木薯基因組DNA 3 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰氨凝膠電泳，硝酸銀染色，照相。endprint

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

SSR引物擴(kuò)增到所有差異譜帶，按擴(kuò)增片段從大到小的順序編號(hào)，純合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點(diǎn)譜帶的代碼；雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點(diǎn)上2個(gè)不同的譜帶。小片段在前，大片段在后。用Popgene觀察等位基因數(shù)（Na）、計(jì)算有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳多樣性（GD）和Shannon's信息指數(shù)（I）[15]。利用Ntsys分析軟件進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)計(jì)算，并按UPGMA法進(jìn)行聚類分析[16]。利用Powermarker軟件計(jì)算SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC）。PIC=1-∑Pi2，其中Pi表示i位點(diǎn)的基因頻率[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物多態(tài)性篩選

利用4份木薯資源對(duì)160對(duì)引物進(jìn)行篩選，共篩選出44對(duì)具有多態(tài)性好且擴(kuò)增條帶清晰的引物。利用44對(duì)引物對(duì)195份木薯材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，共產(chǎn)生等位基因數(shù)為186個(gè)，每對(duì)引物產(chǎn)生等位基因數(shù)為2～8個(gè)，平均數(shù)為4.23個(gè)；C39擴(kuò)增出的等位基因最多，共有8個(gè)等位基因；44對(duì)SSR引物平均有效等位基因數(shù)為2.53個(gè)，變異范圍為1.30～4.69個(gè)；平均Shannon's 信息指數(shù)I為1.01；44對(duì)引物的基因多樣性變幅為0.20～0.76，平均值為0.56，其中引物C24的多態(tài)性最高為0.76；44對(duì)引物的PIC值變幅為0.23～0.79，平均值為0.49，所有引物中PIC值小于0.3的有4個(gè)，其中C32的多態(tài)性最低，PIC值僅為0.20（表2）。SSR分子標(biāo)記引物C124擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見(jiàn)圖1。

2.2 種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)及聚類分析

根據(jù)SSR分子標(biāo)記統(tǒng)計(jì)不同基因型的數(shù)據(jù)結(jié)果，利用NTSYS-pc V2.10軟件，計(jì)算195份木薯種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，得到相似系數(shù)矩陣。結(jié)果表明，195份種質(zhì)遺傳相似系數(shù)變化范圍是0.57～0.99，平均值為0.72。由相似系數(shù)獲得的次數(shù)分布見(jiàn)圖2，遺傳相似性主要集中在0.65～0.80，占85%；分布于兩邊的不到10%，說(shuō)明木薯種質(zhì)的遺傳性狀差異較小，多樣性較低。

采用NTSYS-pc V2.10軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，根據(jù)195份木薯種質(zhì)遺傳相似系數(shù)矩陣，在相似系數(shù)為0.71時(shí)，將195份種質(zhì)劃分為7個(gè)類群。各個(gè)類群的遺傳多樣性水平在0.419～0.944（表3），說(shuō)明195份木薯種質(zhì)資源類型不夠豐富，如各類群群內(nèi)品系之間雜交，后代可進(jìn)行遺傳改良的潛力較小，應(yīng)選擇類群間材料進(jìn)行雜交組合。

根據(jù)NTSYS-pc V2.10軟件計(jì)算的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)表4。當(dāng)以遺傳相似系數(shù)0.71為閾值時(shí)，195份材料劃分為7個(gè)類群：類群A包括國(guó)內(nèi)大部分的育成品種或品系、地方品種；以SC11等來(lái)自不同地區(qū)的15份材料組成類群B；以巴西種質(zhì)和部分國(guó)內(nèi)地方品種為代表材料組成類群C；以大部分瑞士材料為代表材料組成類群D；以CM483-2、CM769-2和瑞士J17組成類群E；以大部分來(lái)源哥倫比亞和泰國(guó)的材料組成類群F；DCU81為類群G（表4）。

2.3 種質(zhì)資源的遺傳信息多樣性分析

進(jìn)一步比較國(guó)內(nèi)選育品種、地方品種、品系和國(guó)外引進(jìn)品系間的遺傳信息多樣性，結(jié)果（表5）發(fā)現(xiàn)，引進(jìn)品種（系）的Na、Ne、I、GD和PIC值均高于或接近國(guó)內(nèi)品種、地方品種（系），說(shuō)明國(guó)外材料的遺傳差異更豐富。

3 討論與結(jié)論

從SSR分子標(biāo)記遺傳相似系數(shù)結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)，GS值絕大部分集中在0.65～0.80，GS大于0.70的種質(zhì)數(shù)量比較密集。這些結(jié)果說(shuō)明，盡管供試木薯種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)相對(duì)比較狹窄，但仍然具有一定的遺傳多樣性。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者周建國(guó)等[4]、彭靖茹等[5]、薛月寒等[8]及國(guó)外學(xué)者Kabeya等[18]、Costa等[19]都利用分子標(biāo)記研究木薯種質(zhì)的遺傳多樣性，且涉及的木薯種質(zhì)從東南亞、南美、非洲等地引入，研究結(jié)果均顯示，現(xiàn)有木薯種質(zhì)間的遺傳變異水平較低。木薯原始種質(zhì)通過(guò)品種引進(jìn)，但其基因型并未發(fā)生很大變化。因此，DNA水平的分子標(biāo)記對(duì)木薯種質(zhì)資源的多樣性評(píng)價(jià)可為育種工作提供更加可靠的信息。

在本研究中，195份材料的平均相似系數(shù)為0.72，而且來(lái)源于不同國(guó)家和地區(qū)的種質(zhì)都不能明顯聚類，僅有幾個(gè)來(lái)源地相近的種質(zhì)表現(xiàn)出較多相似的形態(tài)特征?？赡苁且?yàn)槟臼碓谧匀粭l件下，其不斷的雜交，基因位點(diǎn)雜合度較高，加上長(zhǎng)期以來(lái)主要依靠莖桿進(jìn)行無(wú)性繁殖，使得人工選擇較少。同時(shí)，國(guó)際上最具影響力的木薯科研和種質(zhì)資源庫(kù)CIAT（International Center for Tropical Agriculture，國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)中心）和IIAT（International Institute of Tropical Agriculture，國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究所）一直致力于不同國(guó)家和地區(qū)間的木薯雜交育種和種質(zhì)交流，使得同一木薯種質(zhì)被引種到世界各地，為適應(yīng)當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境發(fā)生了適應(yīng)性的分化、變異并隨著無(wú)性繁殖，在世代交替的群體中累計(jì)，最后形成了某些表型差異大，遺傳距離卻相近的品種。另外，本研究比較國(guó)內(nèi)選育品種、地方品種、品系和國(guó)外引進(jìn)品系間的遺傳信息多樣性，發(fā)現(xiàn)國(guó)外材料遺傳差異更豐富，對(duì)于常規(guī)育種，為拓寬遺傳變異范圍，實(shí)現(xiàn)品種的快速突破，親本選配時(shí)應(yīng)多用國(guó)外品系。

參考文獻(xiàn)

[1] Balagopalan C. Cassava utilization in food，feed and industry[C]//Hillocks R J，Thresh J M，Bellotti A C（eds.）. Cassava：biology，production and utilization. Wallingford：CABI Publishing， 2002： 301-318.endprint

[2] 葉劍秋. 我國(guó)木薯選育種進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，29（11）：115-119.

[3] 夏志強(qiáng)，鄒枚伶，王文泉. 木薯SRAP擴(kuò)增體系的建立與優(yōu)化[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（10）：457-460.

[4] 周建國(guó)，李開(kāi)綿，葉劍秋，等. 應(yīng)用SRAP標(biāo)記研究木薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16（5）：45-55.

[5] 彭靖茹，馬增風(fēng)，黎 萍，等. 木薯種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（6）：58-62.

[6] 韋祖生，夏志強(qiáng)，李開(kāi)綿等. 木薯種質(zhì)庫(kù)遺傳多樣性的EST-SSR標(biāo)記[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2008，29（3）：304-309.

[7] 羅 霆. 木薯種質(zhì)資源的SSR鑒定與分類[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2005.

[8] 薛月寒，吳文嬙，葉劍秋，等. 木薯種質(zhì)的遺傳多樣性評(píng)價(jià)及高產(chǎn)種質(zhì)初級(jí)篩選[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014，15（1）：74-83.

[9] Kenneth M O. SNPs，SSRs and inferences on cassava's origin. Plant germplasm collection in Brazil using PCR-based markers[J]. Molecular Biology，2004， 56（3）： 517-526.

[10] 張振文，姚慶群，許瑞麗，等. 我國(guó)主要木薯品種AFLP多態(tài)性分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，23（5）：1 606-1 609.

[11] 王 慧，盧有林，孫大鵬，等. 糯玉米種質(zhì)品質(zhì)性狀鑒定和SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14（5）：800-808.

[12] 田大剛，林 艷，劉華清，等. 123份水稻重要品種的SSR核心標(biāo)記指紋分析[J]. 分子植物育種，2013，11（1）：20-29.

[13] 李海燕，韓英鵬，武小霞，等. 大豆維生素E遺傳圖譜構(gòu)建及QTL分析[J]. 大豆科學(xué)，2014，33（4）：492-496.

[14] Sraphet S， Boonchanawiwat A， Thanyasiriwat T， et al. SSR and EST-SSR-based genetic linkage map of cassava（Manihot esculenta Crantz）[J]. Theor Appl Genet 2011， 122（6）： 1 161-1 170.

[15] Yeh F C， Boyle T J B. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits[J]. Belgian Journal of Botany， 1997， 129（1）： 157.

[16] Nei M，Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1979， 76（12）： 5 269-5 273.

[17] Liu K， Muse S V. Powermarker：Integrated analysis environment for genetic marker data[J]. Bioinformatics， 2005， 21（9）： 2 128-2 129.

[18] Kabeya M J， Kabeya U C， Bekele B， et al. Genetic analysis of selected cassava（Manihot esculenta） genetic pool in Africa assessed with simple sequence repeats[J]. World J Arici Sci， 2012， 8（6）： 637-641.

[19] Costa T R，F(xiàn)ilho P S V，Goncalves-Vidigal M C，et al. Genetic diversity and population structure of sweet cassava using simple sequence repeat（SSR）molecular markers[J]. African J Biotech， 2013， 12（10）： 1 040-1 048.endprint