• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    血漿DLC-1甲基化與肝細(xì)胞性肝癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系*

    2015-12-09 03:22:06茅國(guó)新
    交通醫(yī)學(xué) 2015年5期
    關(guān)鍵詞:甲基化肝細(xì)胞血漿

    劉 艷,蓋 領(lǐng),茅國(guó)新

    (南通大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤化療科,江蘇226001)

    血漿DLC-1甲基化與肝細(xì)胞性肝癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系*

    劉 艷**,蓋 領(lǐng),茅國(guó)新

    (南通大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤化療科,江蘇226001)

    目的:研究肝細(xì)胞性肝癌患者血漿DLC-1甲基化狀態(tài),研究其與各臨床相關(guān)因素的關(guān)系及對(duì)肝細(xì)胞性肝癌患者預(yù)后的意義。方法:采用甲基化特異性PCR法檢測(cè)肝細(xì)胞性肝癌患者和健康人群血漿中提取DNA的DLC-1甲基化狀態(tài),結(jié)合臨床特征(性別、年齡、肝硬化、AFP水平、HbsAg及臨床分期),分析DLC-1甲基化狀態(tài)與肝細(xì)胞性肝癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:96例肝細(xì)胞性肝癌患者血漿中DLC-1甲基化陽(yáng)性率為30.2%,對(duì)照健康組無(wú)甲基化,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肝細(xì)胞性肝癌患者血漿DLC-1甲基化狀況與性別、年齡、抗-HBV、肝硬化無(wú)相關(guān)性(P>0.05),與HBsAg、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05)。DLC-1甲基化陽(yáng)性組較陰性組轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高,存活率較甲基化陰性組低。結(jié)論:DLC-1基因甲基化狀態(tài)與肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān),對(duì)肝細(xì)胞性肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)具有重要的價(jià)值,有望成為評(píng)估肝細(xì)胞性肝癌預(yù)后的有效指標(biāo)。

    甲基化;DLC-1;肝細(xì)胞性肝癌;預(yù)后

    近年來(lái),多項(xiàng)研究表明基因的異常甲基化與肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后存在緊密關(guān)聯(lián),可能對(duì)肝細(xì)胞性肝癌的診斷、治療以及預(yù)后具有重要價(jià)值[5-6]。有研究表明DLC-1基因在肝細(xì)胞性肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌中常低表達(dá)或缺失,DLC-1基因DNA啟動(dòng)子甲基化的改變通常是腫瘤抑制基因未被激活、蛋白未發(fā)揮其作用的重要機(jī)制[7]。DLC-1全稱為肝癌缺失基因1,定位于人類染色體8p22,目前認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因,DLC-1 DNA啟動(dòng)子甲基化的改變通常是作為腫瘤抑制基因未被激活的重要機(jī)制[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)檢測(cè)分析DLC-1基因在肝細(xì)胞性肝癌患者血漿中甲基化狀態(tài),分析血漿甲基化狀態(tài)與HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 收集南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2008年3月—2009年10月間接受肝細(xì)胞性肝癌手術(shù)患者96例外周血,術(shù)后組織標(biāo)本均經(jīng)過病理證實(shí),所有病例均有完整的臨床及隨訪資料,包括男75例,女性21例,抽血均在患者初入院時(shí);96例健康體檢者為健康對(duì)照組,男72例,女24例,2組人員均空腹抽取外周靜脈血(抗凝),血液標(biāo)本5mL,離心5~10分鐘,取上層血漿,-80℃低溫冰箱凍存或立即提取DNA。所有患者入組前均經(jīng)知情同意,并簽署知情同意書。

    1.2 主要試劑 Takara(寶生物工程大連公司)DNA提取試劑盒;EZ DNA甲基化試劑盒(北京天漠公司);2XTag PCR MasterMix(北京天根公司);Marker(北京天根公司);美國(guó)Bio-rad瓊脂糖。

    1.3 MSP方法 從患者和健康體檢者血漿中提取DNA,設(shè)計(jì)合成MSP引物,PCR反應(yīng)體系:引物3μL,模板 3μL,10×PCR緩沖液 2.5μL,2.0mmol/L 4× dNTP混合物0.5μL,TaKaRaTM熱啟動(dòng)Taq 0.5μL,25mmol/L MgCl22μL,甲基化擴(kuò)增體系總體積為14.5μL。PCR反應(yīng)過程:預(yù)變性95°C 12分鐘,40個(gè)循環(huán)變性94°C 15秒,退火55°C 30秒,延伸72°C 40秒,延伸72°C 10分鐘,甲基化擴(kuò)增體系除了退火溫度提高到56°C外其他均相同。判斷標(biāo)準(zhǔn):(1)甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶,非甲基化特異性引物無(wú)條帶擴(kuò)增出,判斷為甲基化;(2)非甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶,甲基化引物無(wú)條帶擴(kuò)增出,判斷為非甲基化;(3)2對(duì)引物均擴(kuò)增出目的條帶,這種情況稱為半甲基化或部分甲基化,也判斷為甲基化。

    根據(jù)GenBank的甲基化引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成:

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組資料采用EpiData 3.02軟件錄入數(shù)據(jù),SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料差異性比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),生存分析采用Kaplan-Meier法,生存檢驗(yàn)采用Log-rank檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。單因素和多因素COX回歸分析計(jì)算比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)。

    2 結(jié) 果

    2.1 MSP檢測(cè)HCC患者血漿DLC-1甲基化狀態(tài)在肝細(xì)胞性肝癌患者DLC-1血漿甲基化率為30.2%(29/96),正常對(duì)照人群中均未有甲基化,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DLC-1基因啟動(dòng)子甲基化與96例肝細(xì)胞性肝癌患者的臨床特征關(guān)系見表1,肝細(xì)胞性肝癌患者血漿DLC-1基因甲基化狀態(tài)與HBsAg是否陽(yáng)性、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。在肝細(xì)胞性肝癌患者中,HBsAg陰性者DLC-1甲基化陽(yáng)性率顯著高于HBsAg陰性者(P= 0.024);腫瘤<6cm者DLC-1甲基化陽(yáng)性率顯著高于腫瘤>6cm者(P=0.01);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者甲基化陽(yáng)性率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P=0.041);晚期患者甲基化率顯著高于早期患者(P=0.013),而與患者年齡、性別、抗-HBV狀態(tài)、AFP水平及是否肝硬化間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.2 DLC-1甲基化狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)系 隨訪96例肝細(xì)胞性肝癌患者是否發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)或死亡,部分患者未完全按照指定時(shí)間進(jìn)行復(fù)查,直至病情嚴(yán)重時(shí)才得以確定復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,故以發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的具體時(shí)間為入院確診當(dāng)天。其中5例失訪,截尾數(shù)據(jù)認(rèn)為失訪患者死亡。96例肝細(xì)胞性肝癌患者中位無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)為8.2月,總生存期為17.5月。

    表1 甲基化狀態(tài)與肝細(xì)胞性肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系

    對(duì)96例肝細(xì)胞性肝癌患者隨訪12個(gè)月,DLC-1甲基化陽(yáng)性患者死亡率為89.65%(26/29),DLC-1甲基化陰性患者,疾病進(jìn)展率為26.87%(18/ 67),死亡率73.13%(49/67);DLC-1甲基化陽(yáng)性患者與陰性患者PFS分別為5.1月和7.1月,OS分別為14.7月和25.8月,DLC-1甲基化陽(yáng)性患者PFS、OS均短于陰性患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1、2)。

    圖1 DLC-1甲基化陽(yáng)性與陰性肝細(xì)胞性肝癌患者PFS曲線圖

    圖2 DLC-1甲基化陽(yáng)性與陰性肝細(xì)胞性肝癌患者OS曲線圖

    2.3 相關(guān)因素對(duì)肝細(xì)胞性肝癌患者預(yù)后影響的COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 將患者性別、年齡、肝硬化、AFP水平、臨床分期、甲基化表達(dá)情況采用COX模型進(jìn)行多因素回歸分析,結(jié)果顯示除腫瘤大小、TNM分期外(OR=2.366,OR=2.590),血漿DLC-1基因甲基化表達(dá)也是影響患者PFS及OS的獨(dú)立因素,相對(duì)危險(xiǎn)度分別為4.343(P<0.05),見表2。

    表2 肝細(xì)胞性肝癌多因素生存分析結(jié)果

    3 討 論

    惡性腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程,涉及多種基因的功能異常,基因表觀遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。其中DNA甲基化是目前研究最廣泛、也是最重要的表觀遺傳修飾形式之一。DNA甲基化是指將腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下,CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5′位置的氫被活性甲基所取代,從而轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的生物過程。正常的甲基化對(duì)于維持機(jī)體的功能是必需

    的,但通過對(duì)DNA甲基化模式的研究發(fā)現(xiàn),多個(gè)基因異常的DNA甲基化狀態(tài)存在于包括肝細(xì)胞性肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中,隨著對(duì)肝細(xì)胞性肝癌的抑癌基因及其影響因素等研究的深入,DLC-1異常甲基化研究日益受到重視[10-11]。

    DLC-1基因通過GTP酶活性抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移,抑制了一些癌基因的作用元件,從而在原發(fā)性肝癌中執(zhí)行抑制癌細(xì)胞增殖的功能[12];DLC-1基因表達(dá)產(chǎn)物為RhoA和Cdc42特異性的GTP酶激活蛋白,主要通過下調(diào)Rho的活性而抑制腫瘤,與調(diào)控細(xì)胞增殖和粘附的信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)系密切[13],而DNA啟動(dòng)子甲基化的改變通常是腫瘤抑制基因未被激活的重要機(jī)制。

    我們將包括年齡、性別、肝硬化、腫瘤大小等在內(nèi)的臨床參數(shù)資料與DLC-1甲基化進(jìn)行了研究。與HbsAg相關(guān)性研究提示,DLC-1基因甲基化狀態(tài)與HBV感染有著顯著的關(guān)聯(lián)性(P=0.024)。DLC-1基因甲基化在HBV感染的肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的重要作用,其臨床意義有待于進(jìn)一步探討。與臨床分期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤的大小、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與肝細(xì)胞性肝癌甲基化顯著相關(guān),腫瘤越大,轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目越多,DLC-1甲基化越頻繁(P<0.05)。此外,TNM分期與DLC-1甲基化也顯著相關(guān),TNM III~Ⅳ期患者中的甲基化頻率顯著高于TNM I~Ⅱ期患者,且甲基化狀態(tài)呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì),提示抑癌基因DLC-1甲基化是肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生的早期分子事件,隨著腫瘤的進(jìn)展表達(dá)增高(P= 0.013)。其它臨床特征如腫瘤患者年齡、性別及肝硬化、AFP水平等臨床特征與甲基化差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于在本研究中的例數(shù)較少,未檢測(cè)其肝硬化、AFP水平等臨床參數(shù)與DLC-1甲基化表達(dá)的關(guān)系,有待進(jìn)一步加大樣本量研究。

    本實(shí)驗(yàn)探討了DLC-1基因甲基化與肝細(xì)胞性肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系,結(jié)果提示DLC-1甲基化與肝細(xì)胞性肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)顯著相關(guān),DLC-1甲基化可能是預(yù)測(cè)肝細(xì)胞性肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個(gè)獨(dú)立的新的危險(xiǎn)因素,但由于標(biāo)本量和人群種族的限制,今后還需要大規(guī)模多中心的研究加以證實(shí)。

    [1]Wang Z,Zhang L,Shi X,et al.Association between two common polymorphisms and risk of hepatocellular carcinoma:evidence from an updated meta-analysis[Z].2014:468605.

    [2]Cheng Y,Zhang C,Zhao J,et al.Correlation of CpG island methylator phenotype with poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Exp Mol Pathol,2010,88(1):112-117.

    [3]Hsu HS,Wen CK,Tang YA,et al.Promoter hypermethylation is the predominant mechanism in hMLH1 and hMSH2 deregulation and is a poor prognostic factor in nonsmoking lung cancer[J].Clin Cancer Res,2005,11(15):5410-5416.

    [4]Li Z,Zhu WG.Targeting histone deacetylases for cancer therapy:from molecular mechanisms to clinical implications[J].Int J Biol Sci,2014,10(7):757-770.

    [5]Yang M,Park Jy.DNA methylation in promoter region as biomarkers in prostate cancer[J].Methods Mol Biol,2012,863:67-109.

    [6]Rodríguez-Paredes M,Esteller M.Cancer epigenetics reaches mainstream oncology[J].Nat Med,2011,17(3):330-339.

    [7]Radpour R,Barekati Z,Kohler C,et al.Hypermethylation of tumor suppressor genes involved in critical regulatory pathways for developing a blood-based test in breast cancer[J]. PLoS One,2011,6(1):e16080.

    [8]Yuan BZ,Zhou X,Durkin ME,et al.DLC-1 gene inhibits human breast cancer cell growth and in vivo tumorigenicity[J].Oncogene,2003,22(3):445-450.

    [9]Paluszczak J,Baer-Dubowska W.Epigenetic diagnostics of cancer——the application of DNA methylation markers[J].J Appl Genet,2006,47(4):365-375.

    [10]Yuan BZ,Durkin ME,Popescu NC.Promoter hypermethylation of DLC-1,a candidate tumor suppressor gene,in several common human cancers[J].Cancer Genet Cytogenet,2003,140(2):113-117.

    [11]Levenson VV,Melnikov AA.DNA methylation as clinically useful biomarkers-light at the end of the tunnel[J].Pharmaceuticals(Basel),2012,5(1):94-113.

    [12]Kim TY,Jong HS,Song SH,et al.Transcriptional silencing of the DLC-1 tumor suppressor gene by epigenetic mechanism in gastric cancer cells[J].Oncogene,2003,22(25):3943-3951.

    Expression and clinical significance of DLC-1 DNA methylation in hepatocellular cancer

    LIU Yan,GAI Ling,MAO Guoxin
    (Department of Oncology,the Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001)

    Objectives:To analyze the relationship between the promoter region DLC-1 DNA methylation status and the characteristics in hepatocellular cancer,and explore the role of DLC-1 DNA methylation in the occurrence and metastasis of hepatocellular cancer.Methods:96 cases of hepatocellular cancer specimens were selected,the methylation specific-PCR(MSP)was used to detect the tumor suppressor gene DLC-1 methylation in the above-mentioned tissues.To explore their roles of them in the occurrence and development of hepatocellular cancer,and the relationship associated with the clinical relevant factors.And to further analyze of the relationship between the promoter region of DLC-1 methylation status and the characteristics of methylation of the genome-wide in hepatocellular cancer.Disscussion the relationship between the methylation status with clinicopathologic factors(sex,age,AFP,differentiation degree,clinical stage,)and progression-free survival(PFS)as well as overall survival(OS)was analyzed.Results:The methylation status of DLC-1 in plasma of hepatocellular cancer patients was 30.1%.There were no correlations among the DLC-1 methylation status in hepatocellular cancer plasma and the patient's sex,age,cirrhosis and anti-HBV(P>0.05),but it was correlated with degrees of differentiation TNM staging.Multivariate analysis indicated that besides the tumor size,the methylation status is also an independent risk factor influencing recurrence,also independently correlated with TTP and OS in hepatic patients. Conclusions:DLC-1 methylation shows great importance in the field of judging the prognosis.Tumor suppressor gene DLC-1 methylation is an early molecular index of hepatocellular cancer.

    methylation;DLC-1;hepatocellular carcinoma;prognosis

    R735.7

    A

    江蘇省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(H200957)。

    2015-09-19

    1006-2440(2015)05-0443-04

    **[作者簡(jiǎn)介]劉艷,女,漢族,江蘇鹽城人,生于1985年12月,碩士研究生。研究方向:惡性腫瘤化學(xué)治療。 通信作者:茅國(guó)新,E-mail:MAOGX33@163.com

    肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝臟惡性腫瘤,占全球腫瘤發(fā)生率的第五位[1],其發(fā)生發(fā)展涉及染色體畸變、基因突變、表觀遺傳學(xué)改變、生長(zhǎng)因子異常分泌和多種信號(hào)通路異常激活。表觀遺傳修飾主要包括DNA以及一些與DNA密切相關(guān)的蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾,如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA等,其中DNA甲基化(methylation)是目前研究最廣泛、也

    是最重要的表觀遺傳修飾形式之一[2-4]。

    猜你喜歡
    甲基化肝細(xì)胞血漿
    糖尿病早期認(rèn)知功能障礙與血漿P-tau217相關(guān)性研究進(jìn)展
    外泌體miRNA在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展
    血漿置換加雙重血漿分子吸附對(duì)自身免疫性肝炎合并肝衰竭的細(xì)胞因子的影響
    CHF患者血漿NT-proBNP、UA和hs-CRP的變化及其臨床意義
    肝細(xì)胞程序性壞死的研究進(jìn)展
    肝細(xì)胞癌診斷中CT灌注成像的應(yīng)用探析
    腦卒中后中樞性疼痛相關(guān)血漿氨基酸篩選
    鼻咽癌組織中SYK基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化分析
    胃癌DNA甲基化研究進(jìn)展
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    下体分泌物呈黄色| 国产69精品久久久久777片| 国产成人精品婷婷| 久久久久视频综合| 日韩伦理黄色片| 国产 一区精品| 亚洲国产av影院在线观看| 99香蕉大伊视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 一级毛片 在线播放| www.色视频.com| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲欧洲国产日韩| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品人妻久久久影院| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲高清免费不卡视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲国产精品成人久久小说| 一二三四在线观看免费中文在 | 欧美+日韩+精品| 黑丝袜美女国产一区| 国产精品 国内视频| av网站免费在线观看视频| 久久人人爽人人片av| 欧美人与性动交α欧美软件 | 日韩 亚洲 欧美在线| 大香蕉97超碰在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产精品国产三级国产专区5o| 热re99久久精品国产66热6| 超碰97精品在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久久久久人人人人人| 国产深夜福利视频在线观看| 午夜影院在线不卡| 国产又色又爽无遮挡免| 久久女婷五月综合色啪小说| 在线天堂最新版资源| 日韩制服骚丝袜av| 男女国产视频网站| 成人无遮挡网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 大香蕉97超碰在线| 午夜视频国产福利| 街头女战士在线观看网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产永久视频网站| 精品第一国产精品| 久久99热6这里只有精品| 国产不卡av网站在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 九色成人免费人妻av| 国产精品熟女久久久久浪| 国产色爽女视频免费观看| 国产av精品麻豆| 亚洲国产av新网站| 最后的刺客免费高清国语| 欧美丝袜亚洲另类| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲久久久国产精品| 99国产精品免费福利视频| av网站免费在线观看视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 搡女人真爽免费视频火全软件| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 啦啦啦在线观看免费高清www| 大码成人一级视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 9色porny在线观看| 人人澡人人妻人| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 人人澡人人妻人| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 草草在线视频免费看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| av国产久精品久网站免费入址| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 青春草亚洲视频在线观看| 久久 成人 亚洲| 午夜久久久在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| av一本久久久久| 一级片'在线观看视频| xxx大片免费视频| 亚洲av电影在线进入| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 99热国产这里只有精品6| 只有这里有精品99| 男的添女的下面高潮视频| 日韩一本色道免费dvd| 99re6热这里在线精品视频| av视频免费观看在线观看| 亚洲伊人色综图| 国产午夜精品一二区理论片| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 免费av中文字幕在线| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 成人毛片a级毛片在线播放| 97在线视频观看| 麻豆乱淫一区二区| 免费大片黄手机在线观看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲精品日本国产第一区| 人妻 亚洲 视频| 22中文网久久字幕| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日韩av免费高清视频| 九九爱精品视频在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 久久久欧美国产精品| 久久久久精品人妻al黑| 90打野战视频偷拍视频| 视频在线观看一区二区三区| 久久精品国产自在天天线| 777米奇影视久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲精品成人av观看孕妇| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 一级片免费观看大全| 少妇的丰满在线观看| 国产 精品1| 深夜精品福利| 国产一区亚洲一区在线观看| 蜜桃国产av成人99| 亚洲av日韩在线播放| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产男女内射视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 成年美女黄网站色视频大全免费| 黄片播放在线免费| 一个人免费看片子| 亚洲美女黄色视频免费看| 在线观看免费高清a一片| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 日韩免费高清中文字幕av| 人妻 亚洲 视频| 日本色播在线视频| 女性被躁到高潮视频| 亚洲国产精品999| 成人国产麻豆网| 99久国产av精品国产电影| 亚洲精品一二三| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲国产色片| 十八禁网站网址无遮挡| 午夜激情久久久久久久| 久久久精品区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品一区在线观看国产| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 男人舔女人的私密视频| a级毛片在线看网站| av在线播放精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩电影二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品久久久久成人av| 久久毛片免费看一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 亚洲综合精品二区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲国产av影院在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 免费在线观看完整版高清| 精品久久久久久电影网| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 看十八女毛片水多多多| 久久影院123| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲美女黄色视频免费看| 午夜福利影视在线免费观看| 日本黄色日本黄色录像| 久久久久视频综合| 内地一区二区视频在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 中文欧美无线码| 午夜福利影视在线免费观看| 久久av网站| av片东京热男人的天堂| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 乱人伦中国视频| 22中文网久久字幕| av卡一久久| 国产精品人妻久久久久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产乱来视频区| 国产高清不卡午夜福利| 黄片播放在线免费| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲国产av影院在线观看| 99热6这里只有精品| 久久久国产精品麻豆| 有码 亚洲区| 久久久久久久国产电影| 日韩一本色道免费dvd| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品久久蜜臀av无| 韩国精品一区二区三区 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产亚洲一区二区精品| 中文天堂在线官网| av国产久精品久网站免费入址| a级片在线免费高清观看视频| 99热网站在线观看| 飞空精品影院首页| 一区二区三区精品91| 99久久精品国产国产毛片| 在线精品无人区一区二区三| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品久久久av美女十八| 最黄视频免费看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 女人久久www免费人成看片| 黑人猛操日本美女一级片| 韩国精品一区二区三区 | av线在线观看网站| 日本av免费视频播放| 曰老女人黄片| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩视频在线欧美| 日韩精品有码人妻一区| 婷婷成人精品国产| 国产成人精品无人区| 国产成人av激情在线播放| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 一级,二级,三级黄色视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 色5月婷婷丁香| xxx大片免费视频| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 日韩免费高清中文字幕av| 免费看光身美女| 男女高潮啪啪啪动态图| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 99精国产麻豆久久婷婷| 中国三级夫妇交换| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 天堂8中文在线网| 久久久久国产精品人妻一区二区| 男人添女人高潮全过程视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日韩制服骚丝袜av| 热re99久久国产66热| 97在线人人人人妻| 国产成人精品福利久久| 成人国产麻豆网| av电影中文网址| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 午夜激情久久久久久久| 亚洲人与动物交配视频| 久久久久精品人妻al黑| 美女国产视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲伊人色综图| 午夜av观看不卡| 久久久久精品性色| 在线看a的网站| 好男人视频免费观看在线| 亚洲久久久国产精品| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 18禁动态无遮挡网站| 视频在线观看一区二区三区| 97人妻天天添夜夜摸| 色94色欧美一区二区| 综合色丁香网| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产激情久久老熟女| 日日啪夜夜爽| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 飞空精品影院首页| 国产黄频视频在线观看| a级毛色黄片| a级毛片在线看网站| 老司机影院成人| 久久久久久久久久人人人人人人| videossex国产| 九草在线视频观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 蜜桃在线观看..| 日韩av免费高清视频| 国产高清三级在线| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人精品一,二区| 精品国产一区二区久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 午夜av观看不卡| 青春草国产在线视频| av网站免费在线观看视频| 99久国产av精品国产电影| 国产av精品麻豆| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲久久久国产精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 色5月婷婷丁香| 搡老乐熟女国产| 少妇的逼水好多| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av片东京热男人的天堂| 老女人水多毛片| 少妇人妻久久综合中文| 日日啪夜夜爽| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| av黄色大香蕉| 成人国产av品久久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产成人精品福利久久| 热re99久久国产66热| 少妇高潮的动态图| 美女内射精品一级片tv| 亚洲人成77777在线视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 成人亚洲精品一区在线观看| 99九九在线精品视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美人与善性xxx| 国产精品女同一区二区软件| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 色视频在线一区二区三区| 久久av网站| 成人漫画全彩无遮挡| av视频免费观看在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 午夜免费男女啪啪视频观看| 搡老乐熟女国产| 久久精品国产自在天天线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美人与善性xxx| 亚洲综合色网址| 内地一区二区视频在线| 制服诱惑二区| 99久国产av精品国产电影| 午夜福利,免费看| 亚洲国产av影院在线观看| 自线自在国产av| 又大又黄又爽视频免费| 99久久人妻综合| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜精品国产一区二区电影| 少妇人妻 视频| 亚洲伊人色综图| 日韩精品有码人妻一区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 五月玫瑰六月丁香| 精品人妻在线不人妻| 激情五月婷婷亚洲| 免费在线观看完整版高清| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99国产精品免费福利视频| 免费观看性生交大片5| 日本黄色日本黄色录像| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 热99国产精品久久久久久7| 久久99一区二区三区| 美女国产高潮福利片在线看| 1024视频免费在线观看| 激情视频va一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 最新的欧美精品一区二区| 久久久精品区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 午夜福利视频在线观看免费| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久97久久精品| 女人久久www免费人成看片| 久久午夜福利片| 中文字幕人妻丝袜制服| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品成人在线| 久久久久久人人人人人| 国产成人免费观看mmmm| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产一区二区激情短视频 | 日本色播在线视频| 久久久久久久国产电影| 国产成人免费观看mmmm| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美日韩成人在线一区二区| 飞空精品影院首页| av免费在线看不卡| 午夜免费观看性视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产综合精华液| 不卡视频在线观看欧美| 大片免费播放器 马上看| av.在线天堂| 成人无遮挡网站| 在线天堂中文资源库| 国产成人91sexporn| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产又爽黄色视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产69精品久久久久777片| 亚洲人成77777在线视频| 成人漫画全彩无遮挡| 久久精品国产亚洲av天美| freevideosex欧美| 美国免费a级毛片| 亚洲人成77777在线视频| 久久精品国产综合久久久 | 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲性久久影院| 少妇的逼好多水| 伊人久久国产一区二区| 91国产中文字幕| 国产xxxxx性猛交| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久热这里只有精品99| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产一区二区激情短视频 | 日本欧美视频一区| 女人精品久久久久毛片| 欧美成人午夜免费资源| 丝袜喷水一区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 一级爰片在线观看| 一个人免费看片子| 熟女av电影| 中国三级夫妇交换| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 九色亚洲精品在线播放| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产av国产精品国产| 欧美97在线视频| 午夜久久久在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲综合色网址| 日韩一区二区视频免费看| 精品一区在线观看国产| 国产av一区二区精品久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 久久免费观看电影| 熟女人妻精品中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 99热6这里只有精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 天堂8中文在线网| 另类亚洲欧美激情| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品国产一区二区久久| 国产爽快片一区二区三区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美精品亚洲一区二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 五月天丁香电影| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久午夜福利片| 亚洲av电影在线进入| 美女内射精品一级片tv| 老司机影院毛片| videossex国产| 国产av码专区亚洲av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 人人澡人人妻人| 成年女人在线观看亚洲视频| 男男h啪啪无遮挡| 在线天堂中文资源库| 最后的刺客免费高清国语| 在线精品无人区一区二区三| 精品第一国产精品| 亚洲,欧美精品.| 亚洲内射少妇av| 亚洲少妇的诱惑av| 色吧在线观看| 在线观看人妻少妇| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成人免费观看视频高清| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产 一区精品| 一级爰片在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 欧美激情 高清一区二区三区| 伦理电影免费视频| 久久鲁丝午夜福利片| 五月天丁香电影| 美女主播在线视频| 精品一品国产午夜福利视频| 国精品久久久久久国模美| 永久免费av网站大全| 国产精品久久久久久久久免| 久久人人爽人人爽人人片va| 岛国毛片在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 国产黄频视频在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 男女边吃奶边做爰视频| 赤兔流量卡办理| av一本久久久久| 高清视频免费观看一区二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 高清av免费在线| 免费少妇av软件| 日韩av免费高清视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 人妻 亚洲 视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产精品熟女久久久久浪| 熟女电影av网| www日本在线高清视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男人操女人黄网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 蜜桃国产av成人99| 成人国产麻豆网| 一个人免费看片子| 精品久久国产蜜桃| 免费看不卡的av| 久久精品久久精品一区二区三区| videosex国产| 高清欧美精品videossex| 日韩人妻精品一区2区三区| av电影中文网址| av网站免费在线观看视频| 性色av一级| 人人妻人人澡人人看| 国产精品久久久av美女十八| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲久久久国产精品| 毛片一级片免费看久久久久| 99国产综合亚洲精品| 久久久久精品性色| 成人手机av| 中文字幕免费在线视频6| 国产一区二区在线观看av| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品一区二区在线不卡| 成人免费观看视频高清| 日韩一区二区三区影片| 五月玫瑰六月丁香| 看十八女毛片水多多多| 青春草国产在线视频| 在线观看三级黄色| 久久久久久久久久久免费av| 三级国产精品片| 亚洲av男天堂| 亚洲精品美女久久av网站| 一二三四在线观看免费中文在 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲欧洲日产国产| 九九在线视频观看精品| 亚洲av综合色区一区| 九色成人免费人妻av| 亚洲成人av在线免费| 亚洲精品456在线播放app| 欧美国产精品一级二级三级| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产亚洲最大av| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品一区二区在线不卡| 在线看a的网站| 亚洲国产精品国产精品| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 丝瓜视频免费看黄片| 黄片播放在线免费| 久久久亚洲精品成人影院| 乱码一卡2卡4卡精品|