小金蝠蛾的生態(tài)型研究

張德利，涂永勤

(重慶市中藥研究院，重慶 400065)

小金蝠蛾Thitarodes xiaojinensisi Tu 是四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣冬蟲夏草的寄主昆蟲(涂永勤，2009)。按現(xiàn)在分類小金蝠蛾應(yīng)屬鱗翅目Lepidoptera 蝙蝠蛾科 Hepialidae 鉤蝠蛾屬Thitarodes (Viette，1968)。在收集繁育小金蝠蛾過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同鄉(xiāng)的小金蝠蛾體色及斑紋有較大差異，同一花色的個(gè)體有的鮮艷，有的暗淡。通過(guò)集中羽化后，對(duì)這些成蟲個(gè)體的色澤和斑紋進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)小金蝠蛾主要有兩個(gè)主要類型。兩者在外形上有一定的差別，主要表現(xiàn)在體色和翅斑紋。一種體表及翅面附有褐色(鐵銹色)鱗片，褐色與白色相間斑紋，另一種為黑白斑紋或條紋。在分布上也有一定差異，前者主要分布在海拔3400-4800 m，后者主要分布在2800-3600 m，亦有混合分布區(qū)域(涂永勤，2013)。成蟲交尾有兩個(gè)明顯的高峰時(shí)間(涂永勤，2011)，一個(gè)交尾高峰為18∶00-18∶30;另一個(gè)高峰為20∶00-20∶30。因此，兩者可能為不同物種。有研究認(rèn)為中國(guó)的蝠蛾主要屬窄域分布類型，有95%的種類分布區(qū)域狹窄，常常是不同地區(qū)或者不同山脈就形成完全不同的種類，甚至是同一山脈在不同坡向和海拔就形成完全不同的物種(楊大榮，1996)。為了確證分布在小金縣冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)的寄主蝠蛾的兩個(gè)主要類群是否為不同物種，本文從外部形態(tài)、生殖器構(gòu)造和分子生物學(xué)進(jìn)行比較研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 寄主昆蟲

采自小金縣崇德、新橋、雙柏、八角、木坡、撫邊、兩河等鄉(xiāng)海拔2800-4800 m 的草地、耕地或退耕還林地的小金蝠蛾蛹。將不同地點(diǎn)(鄉(xiāng))采集到的蛹在康定冬蟲夏草基地羽化為成蟲，將收集到的成蟲用毒瓶毒死后展翅于泡沫板上，供實(shí)驗(yàn)用標(biāo)本。

1.1.2 主要試劑

本實(shí)驗(yàn)用到的試劑有基因組DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、克隆載體、感受態(tài)細(xì)胞和PCR 試劑等，詳情見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)用試劑及試劑盒種類、型號(hào)及生產(chǎn)商Table 1 Test kit reagents and type，model and manufacturer

1.1.3 主要儀器

PCR 擴(kuò)增儀:Applied Biosystems (9700);高速低溫離心機(jī)，常溫離心機(jī):由德國(guó)Sigma 公司生產(chǎn);恒溫水浴鍋:日本三洋公司生產(chǎn);電泳儀和電泳槽:美國(guó)Bio-Rad 公司生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng):Gel Doc EQ:美 國(guó) Bio-Rad 公司生;4℃、-20℃、-70℃冰箱:日本三洋公司生產(chǎn)。體式顯微鏡及照相系統(tǒng):日本奧林巴斯生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 成蟲形態(tài)觀察

將各采集點(diǎn)羽化的成蟲若干，集中展布在泡沫板上，觀察比較成蟲的外部形態(tài)、色澤和翅斑紋，并描述、拍照及歸類。

1.2.2 雄性外生殖器制備與觀察

用不同外形(色澤和斑紋)的小金蝠蛾雄蟲A 型和B 型各3-5 頭，從腹部第8 節(jié)處剪斷，將腹部末端放入10% NaOH 溶液煮20-30 min，取出外生殖器部分，用清水沖洗掉堿液，并去除多余的組織，置于體式顯微鏡下觀察生殖器構(gòu)造。

1.2.3 分子鑒定

取A 型和B 型小金蝠蛾各5 頭，采用蛋白酶K 法對(duì)其DNA 進(jìn)行提取，用昆蟲COI 通用引物(LCO1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，HCO2198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切割目的片段，用Takara 瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒進(jìn)行回收，樣品由北京六合華大基因科技有限公司合成與檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小金蝠蛾的形態(tài)特征

通過(guò)外形比較，采自小金縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)分布的小金蝠蛾有多種不同色澤和斑紋，但主要有兩種類型(見圖1-6)，兩者的主要差別在于A 型體表有大量褐色絨毛，翅斑紋為褐色與灰白色相間條紋，翅表面附鐵銹色鱗片，與小金蝠蛾模式標(biāo)本相同，見圖1-3。B 型為黑色與灰白色條紋或白色斑紋，見圖4-6。A 型去掉鐵銹色鱗片后，與B 型翅表?xiàng)l紋或斑紋有一定的相似性。同花紋蝠蛾的亦有色澤鮮艷或暗淡的差異。

圖1 小金蝠蛾A 型Fig.1 A type

圖2 小金蝠蛾A 型Fig.2 A type

圖3 小金蝠蛾A 型Fig.3 A type

圖4 小金蝠蛾B 型Fig.4 B type

圖5 小金蝠蛾B 型Fig.5 B type

圖6 小金蝠蛾B 型Fig.6 B type

2.2 小金蝠蛾雄性外生殖器構(gòu)造

A、B 兩型小金蝠蛾的雄性外生殖器在體式顯微鏡下的構(gòu)造如圖7-12 所示。由生殖器構(gòu)造圖可知，兩者最大差異在于A 型的抱器瓣鉤更明顯，呈牛角狀向內(nèi)彎曲弧度較大，B 型的抱器瓣鉤彎度較小，近似直伸。此外，兩者無(wú)較大差別，據(jù)此無(wú)法作為分種的依據(jù)，兩者可能為同一物種。

圖7 A 型雄性外生殖器-1Fig.7 Type A male genitals-1

圖8 A 型雄性外生殖器-2Fig.8 Type A male genitals-2

圖9 A 型右抱器瓣Fig.9 Type A right lobe

圖10 B 型雄性外生殖器-1Fig.10 Type B male genitals-1

圖11 B 型雄性外生殖器-2Fig.11 Type B male genitals-2

圖12 B 型左抱器瓣Fig.12 Type B left clasper disc

2.3 分子生物學(xué)鑒定

小金蝠蛾COⅠ序列測(cè)定結(jié)果為含有658 bp的序列，該序列已申請(qǐng)并獲得序列號(hào):GenBank KP772242 供查詢。與人支蝠蛾、蒲氏蝠蛾及家蠶等已知序列進(jìn)行比對(duì)，并應(yīng)用MEGA 5.05 軟件計(jì)算其遺傳距離，結(jié)果見表2。從表2 可知:根據(jù)K-2-P 模型得出包括外群在內(nèi)的遺傳距離D，由COI 基因片段所得到的遺傳距離中，同樣花紋的樣品XJ-A 和XJ-B種間的遺傳距離分別為0.000和0.009;不同花紋XJ-A 和XJ-B 的樣品間的遺傳距離在0.002-0.008 之間;XJ-A 和XJ-B與兩個(gè)同屬種的遺傳距離0.048-0.084 之間;XJ-A 和XJ-B 與外群Bombyx mori 遺傳距離為0.178 和0.180?？梢娦〗痱鸲闍 型和B 型之間遺傳距離最近，兩者的相似度達(dá)99.2%，不足以達(dá)到物種差異的標(biāo)準(zhǔn)。所以，兩者應(yīng)為同一物種，小金蝠蛾A 型和B 型應(yīng)屬于同一物種不同的生態(tài)類型。它們?cè)诜植挤秶蜕盍?xí)性上都有一定的差異。但尚未分化為不同的物種。

表2 4 個(gè)樣品的COⅠ基因的K-2-P 遺傳距離和標(biāo)準(zhǔn)誤差Table 2 Genetic identity and distance of geographic populations of Thitarodes xiaojinensis

3 結(jié)論與討論

綜上所述，在小金縣冬蟲夏草主要產(chǎn)區(qū)分布的小金蝠蛾，我們通過(guò)從形態(tài)上、雄性外生殖器構(gòu)造和分子生物學(xué)等進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明:在外形上有一定的差異、且雄性外生殖器構(gòu)造有變異的兩類蝠蛾均為小金蝠蛾。蝠蛾外形色澤及斑紋差異明顯的兩類應(yīng)為小金蝠蛾的不同生態(tài)型。且可分為高山型(A 型)和低山型(B 型)。高山型(A 型)主要分布在海拔3400-4800 m 的高山草甸地帶，低山型(B 型)分布在2800-3600 m的耕地、退耕還林地及草地，兩者能正常交配、產(chǎn)卵、并孵化為幼蟲，經(jīng)化蛹、羽化的后代亦能正常交配產(chǎn)卵。此外，我們?cè)谒拇刀ú杉暩买鸲陼r(shí)，亦有很多色澤或斑紋各異的蛾子，但他們能彼此正常交配、產(chǎn)卵，卵亦能孵化為幼蟲。由此可見，分布在一定范圍的蝠蛾由于環(huán)境的差異，種群發(fā)生分化，產(chǎn)生變異，在外部形態(tài)上表現(xiàn)出來(lái)，如果進(jìn)一步發(fā)生變異，即可分化為不同的物種。小金蝠蛾這種在不同海拔分布的物種，由于環(huán)境的差異，種群發(fā)生了明顯分化，在外形上及生殖器上均有一定變化，但尚未分化為不同的物種，其遺傳分化規(guī)律有待深入研究。所以，認(rèn)為在不同坡向和海拔高度分布的蝠蛾已分化為不同物種的可能性還值得商榷，可能需要更多的證據(jù)來(lái)支持。

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