乙型肝炎表面抗原定量檢測技術(shù)與乙型肝炎病毒DNA相關(guān)性研究進(jìn)展

柯柳華(綜述)，馬興璇,覃彥平(審校)

(1.柳州市中醫(yī)院檢驗科,廣西 柳州 545001； 2.柳州市紅十字會醫(yī)院檢驗科，廣西 柳州 545001)

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乙型肝炎表面抗原定量檢測技術(shù)與乙型肝炎病毒DNA相關(guān)性研究進(jìn)展

柯柳華1(綜述)，馬興璇1,覃彥平2※(審校)

(1.柳州市中醫(yī)院檢驗科,廣西 柳州 545001； 2.柳州市紅十字會醫(yī)院檢驗科，廣西 柳州 545001)

摘要：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒(HBV)感染的標(biāo)志，HBsAg定量能監(jiān)控和預(yù)測患者抗病毒治療的療效。 HBV DNA是檢測HBV有無復(fù)制及傳染性最直接、特異性強(qiáng)和靈敏性高的指標(biāo)。臨床往往通過監(jiān)測HBsAg和(或)HBV DNA定量水平，評估抗病毒療效，指導(dǎo)、調(diào)整治療方案。目前有關(guān)HBsAg與HBV DNA的相關(guān)性報道較多，該研究重點闡明在不同因素影響下HBsAg與HBV DNA的變化情況及關(guān)聯(lián)性。

關(guān)鍵詞：慢性乙型肝炎；乙型肝炎表面抗原定量；乙型肝炎病毒 DNA

定量檢測乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是目前監(jiān)控和預(yù)測抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)治療的一種新工具，能更準(zhǔn)確地預(yù)測患者抗病毒治療的短期和長期療效。血清HBV DNA可直接反映HBV復(fù)制活動和傳染性，在監(jiān)測和評估急性和慢性乙型肝炎抗病毒療效及預(yù)后具有重要意義。但由于HBV DNA檢測受到試劑價格、實驗室要求等的限制,存在須經(jīng)過專門的培訓(xùn)人員才能操作、檢測方法缺乏統(tǒng)一性和標(biāo)準(zhǔn)化、各種試劑有不同的線性范圍、不易普及等不足之處。相對而言，定量檢測HBsAg則具有操作簡便、快捷、試劑成本低、檢測價格及對實驗場地的要求相對不高、較易開展的優(yōu)勢。因此，定量檢測HBsAg 替代HBV DNA檢測的研究，近年來已成為一個熱點?，F(xiàn)對HBsAg定量和血清HBV DNA之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行綜述。

1關(guān)于HBsAg

1965年澳大利亞科學(xué)家Blumberg首次報道澳大利亞抗原,后來研究表明澳大利亞抗原即是HBV表面的膜蛋白顆粒，因此將澳大利亞抗原改稱為HBsAg[1]。HBsAg是病毒的外膜結(jié)構(gòu)蛋白多肽，人體感染HBV后4～7周就能從血清內(nèi)檢測到HBsAg，雖然HBsAg本身沒有傳染性，但它是HBV感染后最早出現(xiàn)的病毒抗原，與HBV復(fù)制模板——共價閉合環(huán)狀DNA水平有一定的相關(guān)性，故具有非常重要的臨床意義。

在臨床上，乙型肝炎患者最接近治愈的狀態(tài)是HBsAg轉(zhuǎn)陰或血清轉(zhuǎn)換，這是因為HBsAg轉(zhuǎn)陰或血清轉(zhuǎn)換是宿主免疫控制的實現(xiàn)標(biāo)志，代表了患者的HBV復(fù)制得到持續(xù)控制，肝組織炎癥顯著減輕，疾病進(jìn)展緩慢，肝癌和肝硬化的發(fā)生率顯著降低。

因此，HBsAg的檢測在HBV感染診斷方面和抗病毒治療的療效監(jiān)測方面都有重要意義。

2定量HBsAg檢測技術(shù)與發(fā)展

HBV感染的主要標(biāo)志物是血清HBsAg，因此血清HBsAg廣泛應(yīng)用于乙型肝炎初篩和診斷。目前常用血清HBV檢測方法有定性及定量兩種方法。定性法有酶聯(lián)免疫吸附法。定量法根據(jù)檢測原理分為兩種，其中應(yīng)用熒光免疫測定技術(shù)的方法為時間分辨免疫熒光法、微粒子酶測定法等；應(yīng)用化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)的方法有化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。

定量檢測法各有特點和應(yīng)用優(yōu)勢。時間分辨免疫熒光法是以鑭系元素銪(Eu)等作為熒光標(biāo)志物，具有敏感性高、線性范圍廣、精密度好等優(yōu)點；是目前臨床治療藥物檢測最常采用的方法之一[2]?；瘜W(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法是以吖啶酯作為標(biāo)記發(fā)光劑，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好、無放射性危害等優(yōu)點[3]。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法是一種電化學(xué)電極表面的特定的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記，根據(jù)電極發(fā)出光的強(qiáng)度對HBsAg定量檢測，其檢測范圍很廣泛，檢測靈敏度達(dá)pg水平[2]。

3定量檢測HBsAg的臨床意義

歐洲肝臟研究學(xué)會提出，慢性乙型肝炎理想的治療終點是:無論是乙型肝炎e抗原(hepatitis B e-antigen,HBeAg)陽性還是HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者，經(jīng)過有效的抗病毒治療，持續(xù)HBsAg轉(zhuǎn)陰或血清學(xué)轉(zhuǎn)換，不論哪種抗病毒治療的代償性肝病患者達(dá)到此終點即可停止治療[4]，可見定量檢測HBsAg主要用于慢性乙型肝炎患者抗病毒治療療效、決定療程及預(yù)測血清學(xué)轉(zhuǎn)換。Kohmoto等[5]對20例慢性乙型肝炎患者進(jìn)行拉米夫定治療前、后血清比較，發(fā)現(xiàn)抗病毒藥物治療期間，除了可使用HBV DNA水平監(jiān)測血清HBV外，血清HBsAg 濃度的監(jiān)測也可評估拉米夫定的治療，并有助于早期發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。盧建溪等[6]在慢性乙型肝炎HBsAg水平與HBV DNA病毒復(fù)制的相關(guān)性分析中，證實在以干擾素為基礎(chǔ)的慢性乙型肝炎治療期間，HBsAg定量水平與HBV DNA顯著相關(guān)，動態(tài)監(jiān)測HBsAg水平對治療有一定的指導(dǎo)意義。Kittner等[7]研究了接受聚乙二醇干擾素治療的慢性乙型肝炎患者，發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性患者在治療過程中，HBsAg水平持續(xù)下降，24周時HBsAg血清轉(zhuǎn)換。Wang等[8]對242例慢性乙型肝炎患者進(jìn)行了抗原抗體的治療性疫苗和安慰劑的Ⅱb期臨床試驗，結(jié)果表明HBeAg血清轉(zhuǎn)換患者與HBeAg非轉(zhuǎn)換、使用安慰劑組患者相比，HBsAg、HBV DNA和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平持續(xù)減少。分析表明，HBeAg的血清轉(zhuǎn)換是接種疫苗治療的理想終點。另外，HBsAg定量檢測還可預(yù)測新生兒是否發(fā)生免疫失敗。鄧新清等[9]分析了178例新生兒，其母親均為HBsAg和HBeAg陽性，研究發(fā)現(xiàn)孕婦血清高滴度HBsAg與其新生兒疫苗接種免疫失敗有關(guān)。

4HBsAg與HBV DNA定量關(guān)系

4.1HBsAg與HBV DNA的相關(guān)性對于HBsAg水平與HBV DNA定量的相關(guān)性，國內(nèi)外學(xué)者報道不盡一致。任偉宏等[10]對HBsAg陽性的135例患者采用化學(xué)發(fā)光法定量檢測其血清中HBsAg、HBeAg，同時采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測其血清中HBV DNA。發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBeAg濃度值與HBV DNA載量的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.583(P<0.01)、0.550(P<0.01),證實血清HBsAg濃度與HBV DNA載量及HBeAg濃度均呈高度正相關(guān)。陸向東等[11]研究了892例未經(jīng)抗病毒治療的HBsAg陽性孕婦,使用雅培Architect i2000分析儀檢測其血清HBsAg和HBeAg，并用雅培全自動實時熒光定量系統(tǒng)m2000定量檢測HBV DNA水平。檢測表明不同載量HBV DNA組,HBsAg差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，隨HBV DNA水平增加而增加,呈正相關(guān)(r=0.53，P<0.01)，證實在未經(jīng)抗病毒治療的HBsAg陽性孕婦中HBV DNA載量與HBsAg、HBeAg滴度均呈正相關(guān),HBsAg可以較好地反映HBV復(fù)制水平。Ozaras等[12]探討了18例治療過程中的慢性乙型肝炎患者HBsAg定量值和HBV DNA水平的相關(guān)性，患者經(jīng)過聚乙二醇干擾素±拉米夫定52個月的治療，在0、4、8、24、48、52和76周分別采集血清。采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測HBV DNA，化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法檢測HBsAg定量值，兩者表現(xiàn)出顯著相關(guān)性(r=0.85)。

另有研究卻顯示相反的結(jié)果。劉瓊等[13]將316例慢性HBV感染者進(jìn)入研究，其中慢性乙型肝炎119例,肝硬化99例，慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure,ACLF)98例，HBsAg定量采用羅氏電化學(xué)發(fā)光法，HBV DNA定量采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測，結(jié)果表明慢性乙型肝炎、肝硬化和ACLF組患者組間HBsAg和HBV DNA的總體水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Ganji等[14]對伊朗97例慢性乙型肝炎患者HBsAg與HBV DNA水平進(jìn)行相關(guān)性分析，HBV DNA采用實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測，血清HBsAg采用羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測，結(jié)果顯示HBsAg和HBV DNA水平之間無顯著相關(guān)性(r=0.606和r=0.53)。李明慧等[15]探討α干擾素治療期，228例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者血清HBsAg，HBeAg和HBV DNA水平的變化，使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測HBV DNA及ARCHITECH i 2000測量HBsAg，HBeAg水平，結(jié)果顯示在干擾素治療前、后，HBsAg和HBeAg和HBV DNA水平之間沒有顯著的相關(guān)性。

4.2影響HBsAg和HBV DNA之間相關(guān)性的主要因素

4.2.1HBeAg狀態(tài)Gupta等[16]將166例乙型肝炎患者納入研究，結(jié)果顯示HBV DNA和HBsAg呈弱相關(guān)性(r=0.443，P<0.05)，分層分析發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性組的相關(guān)性較好(r=0.402，P<0.05)，HBeAg陰性組卻無相關(guān)性(r=0.193，P=0.05)。Thompson等[17]收集149例治療初期的慢性乙型肝炎患者(HBeAg陽性71例；HBeAg陰性78例)，檢測了HBeAg和HBsAg定量、HBV基因型、血清HBV DNA，在HBeAg陽性慢性乙型肝炎組中，HBsAg與血清HBV DNA和肝組織中共價閉合環(huán)狀DNA水平及總HBV DNA呈正相關(guān)(r=0.69，0.71，0.76，均P<0.01)。在HBeAg陰性慢性乙型肝炎組中，HBsAg與血清HBV DNA的相關(guān)性較差(r=0.28，P=0.01)，與肝內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA水平及總HBV DNA沒有相關(guān)性。Ganji等[14]對伊朗97例慢性乙型肝炎患者采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測HBV DNA及電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清HBsAg，結(jié)果顯示HBV DNA在同一水平時，HBeAg陽性和陰性的患者之間的HBsAg滴度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，HBeAg陰性患者有較高水平的HBsAg，但HBV DNA的水平較低。

4.2.2HBV感染的階段不同裴彥禎等[18]為研究HBV感染的不同期HBsAg與HBV DNA水平的相關(guān)性，將47例慢性乙型肝炎患者(乙型肝炎組)，72例乙型肝炎肝硬化患者(肝硬化組)及54例肝癌患者(肝癌組)納入研究，使用雅培化學(xué)發(fā)光法定量檢測HBsAg，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測HBV DNA，證實HBsAg定量與HBV DNA水平在乙型肝炎組(r=0.297，P<0.05)、肝硬化組(r=0.346，P<0.05)、肝癌組(r=0.452，P<0.05)呈正相關(guān)。黎美祥等[19]將慢性乙型肝炎患者119例和HBV相關(guān)ACLF患者98例納入研究，采用羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測血清HBsAg和HBeAg，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測血清HBV DNA水平。發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性患者血清HBsAg與血清HBV DNA水平及生化指標(biāo)無顯著相關(guān)性(P>0.05)，不同HBV DNA水平ACLF患者中不同HBsAg水平患者的比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，證實了HBV相關(guān)ACLF患者血清HBsAg水平與HBV DNA水平及病情的嚴(yán)重程度無直接平行關(guān)系。Kim等[20]研究645例韓國未經(jīng)抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者不同HBV感染期[免疫耐受期(IT，n=56)、HBeAg陽性慢性乙型肝炎(EPH，n=150)、非活動期(IC,n=274)、HBeAg陰性慢性乙型肝炎(ENH,n=165)]的HBsAg滴度與HBV DNA水平關(guān)系，得出在IT，EPH和IC組HBsAg滴度與HBV DNA水平均相關(guān)(r=0.664，r=0.541，r=0.505，均P<0.001)，但在ENH組無相關(guān)(r=0.093，P=0.321)。Lee等[21]從565例HBsAg較高水平(HBsAg>250 IU/mL)乙型肝炎患者中采集的血清,測定HBsAg 和HBV DNA定量值，結(jié)果顯示HBsAg和HBV DNA定量之間有非常弱的相關(guān)性。分層分析發(fā)現(xiàn)，慢性肝炎乙型肝炎患者組和肝癌患者中兩者也為弱相關(guān)，在肝硬化患者組卻無相關(guān)。

4.2.3HBV基因型的不同HBV存在各種基因型，其對乙型肝炎患者的自然病程、臨床結(jié)局、抗病毒治療等具有影響[22]，Tuaillon等[23]發(fā)現(xiàn)雖然HBsAg定量不受HBV基因型影響，不過在基因型A慢性乙型肝炎患者的HBsAg和HBV DNA水平之間的有關(guān)聯(lián)性(r=0.44，P=0.02)，而在HBV基因型D的患者中兩者卻沒有關(guān)聯(lián)性(r=0.29，P=0.15)。HBsAg和HBV DNA的關(guān)系與HBV基因型有關(guān)。Ganji等[14]和 Jaroszewicz等[24]也證實HBV基因型會影響HBsAg和HBV DNA的關(guān)系。

5結(jié)語

綜上所述，在某些情況下，高載量的HBV DNA與HBsAg定量水平有相關(guān)性，可反映患者體內(nèi)病毒的復(fù)制水平及傳染性。但在不同的HBV感染期、HBeAg狀態(tài)、HBV感染的不同階段及基因型等綜合因素下，其HBsAg定量與HBV DNA水平亦顯示無相關(guān)或弱相關(guān)性，因此，HBV DNA載量與HBsAg定量在疾病過程中的平行關(guān)系仍需進(jìn)一步研究，如能進(jìn)一步證實在哪些具體條件下可用HBsAg替代HBV DNA定量檢測，將會大大減少患者的醫(yī)療開支。

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Research Progress of HBsAg Quantitative Detection Technology and Hepatitis B Virus DNAKELiu-hua1，MAXing-xuan1,QINYan-ping2. (1.DepartmentofClinicalLaboratory,LiuzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,Liuzhou545001,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,iuzhouRedCrossHospital,Liuzhou545001,China)

Abstract:Hepatitis B surface antigen(HBsAg) is a sign of hepatitis B virus(HBV) infection,HBsAg quantitatification can be used to monitor and predict the curative effect of antiviral therapy.HBV DNA is the most direct index to detect HBV replication and infectivity,with high specificity and sensitivity.In clinical antiviral efficacy was assessed by detecting HBsAg and HBV DNA level to guide and adjust the therapy plan.There are a number of reports about the correlation of HBsAg and HBV DNA,and the study is to elucidate different factors affecting the change of HBsAg and HBV DNA and the relevance.

Key words:Chronic hepatitis B； Hepatitis B surface antigen quantitative； Hepatitis B virus DNA

收稿日期：2014-11-03修回日期：2015-08-22編輯：相丹峰

基金項目：廣西柳州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃(2014JC0202 自)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.042

中圖分類號：R446；R575

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)19-3569-04