HPLC法同時(shí)測定側(cè)柏葉、側(cè)柏炭中的7種成分

譚曉亮， 李瑞海

（1.沈陽市中醫(yī)院，遼寧沈陽100020；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

HPLC法同時(shí)測定側(cè)柏葉、側(cè)柏炭中的7種成分

譚曉亮1， 李瑞海2*

（1.沈陽市中醫(yī)院，遼寧沈陽100020；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

目的 建立HPLC法同時(shí)測定側(cè)柏葉、側(cè)柏炭中楊梅苷、槲皮苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮的含有量。方法 側(cè)柏葉、側(cè)柏炭提取液的分析采用Welch Ultimate LP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫；檢測波長330 nm；體積流量1 mL/min。結(jié)果 楊梅苷、槲皮苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線均呈良好的線性關(guān)系 （r＞0.999 5），平均回收率為97.6%～101.1%，RSD＜1.14%（n=6）。結(jié)論 該方法簡便易行，可用于側(cè)柏葉、側(cè)柏炭的含有量測定。

側(cè)柏葉；側(cè)柏炭；楊梅苷；槲皮苷；楊梅素；槲皮素；山柰酚；穗花杉雙黃酮；扁柏雙黃酮；HPLC

側(cè)柏葉為柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和葉，具有涼血止血、化痰止咳、生發(fā)烏發(fā)等作用，可用于治療吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺熱咳嗽、血熱脫發(fā)、須發(fā)早白［1］等癥狀。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)柏葉的主要成分除藥典規(guī)定的槲皮苷外，還含有楊梅苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮等黃酮類化合物，但目前尚未有關(guān)于同時(shí)測定側(cè)柏葉中這7種成分的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法，并利用甲醇-磷酸水溶液系統(tǒng)梯度洗脫，建立同時(shí)測定側(cè)柏葉中7種黃酮類成分的方法，然后測定不同產(chǎn)地側(cè)柏葉、側(cè)柏炭藥材中這些成分的含有量。由于目前普遍認(rèn)為中藥是以多組分協(xié)同而起效，因此本實(shí)驗(yàn)所

建立的多指標(biāo)含有量測定方法對藥材質(zhì)量的控制具有實(shí)際意義，為制定合理的側(cè)柏葉質(zhì)量控制方法和進(jìn)一步的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)［2-9］。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

P230IIUV230II紫外檢測器、EC2006-色譜數(shù)據(jù)處理工作站 （大連依利特分析儀器有限公司）；KQ3200超聲波清洗器 （昆山超聲儀器有限公司）；電子天平 （十萬分之一，德國賽多利斯公司）。槲皮苷 （批號 111538-200504）、槲皮素 （批號10081-00901）對照品 （中國食品藥品檢定研究院）；楊梅苷 （批號20130528）、楊梅素 （批號20130619）、山柰酚 （批號20130623）、穗花杉雙黃酮 （批號 20130713）、扁柏雙黃酮 （批號20140112）對照品 （大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度均＞99%）。HPLC用水為重蒸餾水；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。側(cè)柏葉、側(cè)柏炭經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定，均為柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和葉，藥材具體來源見表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 含有量測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，加甲醇溶解，分別制成含楊梅苷 0.032 mg/mL、槲皮苷0.051 mg/mL、楊梅素0.006 1 mg/mL、槲皮素0.008 2 mg/mL、山柰酚0.007 1 mg/mL、穗花杉雙黃酮0.065 mg/mL、扁柏雙黃酮0.047 mg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取藥材粉末0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件 Welch UltimateLP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇 （A）-0.2%磷酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～8 min， 32%A；8～15 min，32%～62%A）；檢測波長330 nm；體積流量1 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量20μL。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品溶液各20μL，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果，7種對照品的分離度均良好，而且與供試品中其它成分不干擾，見圖1。

圖1 對照品、側(cè)柏葉和側(cè)柏炭的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances，Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取7種對照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，甲醇溶解，定容于10 mL量瓶中，注入HPLC色譜儀，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量 （μg）為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果，7種對照品峰面積RSD值分別為0.83%、1.00%、0.50%、0.60%、0.62%、0.82%、0.77%，說明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取側(cè)柏炭樣品 （江蘇南京產(chǎn)）6份，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果，7種對照品峰面積RSD值分別為1.30%、0.82%、1.00%、1.01%、0.88%、0.31%、0.78%，說明該方法重復(fù)性良好。

表2 7個(gè)黃酮類化合物的回歸方程Tab.2 Regression equations of seven flavonoids

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取側(cè)柏炭樣品 （江蘇南京產(chǎn)）適量，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，7種對照品峰面積RSD值分別為 0.79%、1.36%、1.24%、0.51%、1.37%、1.17%、1.44%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取側(cè)柏炭樣品 （江蘇南京產(chǎn)）6份，每份0.2 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入含楊梅苷0.032 mg/mL、槲皮苷0.051 mg/mL、楊梅素0.006 1 mg/mL、槲皮素0.008 2 mg/mL、山柰酚0.007 1 mg/mL、穗花杉雙黃酮0.065 mg/mL、扁柏雙黃酮0.047 mg/mL的對照品溶液1 mL，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算回收率。結(jié)果，7種對照品的平均加樣回收率分別為98.5%、99.2%、101.0%、100.0%、102.4%、101.2%、99.3%，RSD 值分別 為 0.89%、0.98%、 1.74%、 0.74%、 1.00%、 1.15%、0.71%，符合相關(guān)規(guī)定，回收率良好。

2.9 側(cè)柏葉、側(cè)柏炭中7種成分含有量測定 分別吸取各供試品溶液20μL，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下測定，記錄各供試品中7種對照品的色譜圖，再采用外標(biāo)兩點(diǎn)法，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程進(jìn)行含有量計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地側(cè)柏葉、側(cè)柏炭中7種對照品的含有量 （mg/g）Tab.3 Con tents of seven flavonoids in Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum in different grow ing areas（mg/g）

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)比較了330 nm和254 nm這兩種波長，發(fā)現(xiàn)330 nm處色譜峰的數(shù)目較多，而且分離效果良好，基線較平穩(wěn)，故選用 330 nm作為檢測波長［10］。

本實(shí)驗(yàn)曾參考藥典中卷柏和側(cè)柏葉的提取方法，比較 “加熱回流5 h”和 “超聲處理30 min”在兩種方法，發(fā)現(xiàn)兩者提取效果相當(dāng)，考慮到后者提取速度更快，故選用 “超聲處理30 min”作為提取方法。

不同產(chǎn)地的側(cè)柏葉中均檢出楊梅苷、槲皮苷、楊梅素、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮，但目前藥典僅以槲皮苷成分來評價(jià)其質(zhì)量，因此不夠全面客觀。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的側(cè)柏葉還含有許多穗花杉雙黃酮成分，而且某些產(chǎn)地其含有量比槲皮苷還高。因此，以多組分為指標(biāo)來進(jìn)行中藥質(zhì)量評價(jià)更

具有客觀意義。

另外，不同產(chǎn)地的側(cè)柏炭中均檢出楊梅苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮、楊梅素、槲皮素、山柰酚，并且前四種成分的含有量均比側(cè)柏葉低 （但不能確定側(cè)柏炭是否是同一批次側(cè)柏葉炮制而成），同時(shí)還出現(xiàn)了生品沒有的槲皮素、山柰酚等色譜峰，提示側(cè)柏葉經(jīng)炮制后，可能存在黃酮成分轉(zhuǎn)化的過程，其機(jī)制有待于作進(jìn)一步研究。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］ 于祝婷，單鳴秋.側(cè)柏葉不同物候期槲皮苷含量動(dòng)態(tài)積累研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2011，13（2）：35-36.

［3］ 吳懷恩，甄漢深，韋志英，等.RP-HPLC法同時(shí)測定側(cè)柏葉炭中槲皮素和山柰素的含量［J］.中國藥房，2009，20（12）：934-935.

［4］ 黃櫻華，黃月純，魏 剛，等.正交試驗(yàn)法篩選側(cè)柏葉總黃酮的提取工藝［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（11）：34-37.

［5］ 單鳴秋，高 靜，丁安偉.超高效液相色譜法測定側(cè)柏炭中5個(gè)黃酮類成分［J］.中草藥，2011，42（2）：282-284.

［6］ 于 生，單鳴秋，丁安偉，等.側(cè)柏葉炮制前后總黃酮的含量變化［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2010，24（1）：51-54.

［7］ 申衛(wèi)紅，張子龍，葉家宏，等.側(cè)柏葉及其水煎液HPLC特征圖譜的相關(guān)性研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2013，24（5）：487-490.

［8］ 吳懷恩，甄漢深，韋志英，等.側(cè)柏葉不同炮制品中槲皮苷與槲皮素的含量測定［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（2）：354-356.

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Sim ultaneous determ ination of seven constituents in Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum

TAN Xiao-liang1， LIRui-hai2*

（1.Shenyang Hospital of Traditional ChineseMedicine，Shenyang 1OOO2O，China；2.Collegeof Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 1166OO，China）

AIM To establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of myricetrin，quercitrin，myricetin，quercetin，kaempferol，amentoflavone and hinokiflavone in Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum.METHODS The analyses of C.Platycladi and C.Platycladi Carbonisatum extracts were performed on Welch Ultimate LP-C18column（4.6 mm×250 mm，5μm），mobile phasewasmethanol-0.2%phosphoric acid aqueous solution in a gradient elution mode，detection wavelength was set at330 nm，and flow rate was 1 mL/min.RESULTS The standard curves of myricetrin，quercitrin，myricetin，quercetin，kaempferol，amentoflavone and hinokiflavone had good linear relationships（r＞0.999 5），whose average recoverieswere 97.6%-101.1%with RSD＜1.14%（n=6）.CONCLUSION Thismethod is simple and feasible，which can be used for the content determination of Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum.

Cacumen Platycladi；Cacumen Platycladi Carbonisatum；myricetrin；quercitrin；myricetin；quercetin；kaempferol；amentoflavone；hinokiflavone；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2715-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.030

2015-04-01

譚曉亮 （1973—），男，主管中藥師，從事藥物制劑方面研究。Tel：（024）23899307，E-mail：409928912@qq.com

*通信作者：李瑞海 （1973—），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事藥物制劑方面研究。Tel：（0411）85890183，E-mail：1801517231@qq.com