湖南產(chǎn)石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油成分分析和抑菌活性檢測(cè)

李 娟， 劉清茹， 肖 蘭， 謝 謙， 田小娟， 李順祥*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410208；2.長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙410100）

湖南產(chǎn)石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油成分分析和抑菌活性檢測(cè)

李 娟1，2， 劉清茹1， 肖 蘭2， 謝 謙2， 田小娟2， 李順祥1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410208；2.長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙410100）

目的 研究湖南產(chǎn)石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油的成分組成和體外抑菌活性。方法 水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，GCMS法分析其成分組成，平皿打孔和數(shù)學(xué)級(jí)試管稀釋法測(cè)定其體外抑菌活性。結(jié)果 在石菖蒲揮發(fā)油中鑒定出41個(gè)化合物，主要為甲基胡椒酚 （45.06%）、順式異丁香酚甲醚 （35.51%）、β-細(xì)辛醚 （9.38%）和長(zhǎng)葉松烯 （1.50%）；在水菖蒲揮發(fā)油中鑒定出46個(gè)化合物，主要為β-細(xì)辛醚 （16.58%）、藍(lán)桉醇 （14.38%）、水菖蒲酮 （10.81%）、去羥基異菖蒲烯二醇 （9.33%）、9-柏烷酮 （8.07%）和喇叭烯氧化物 （6.99%）。兩者體外均對(duì)除綠膿桿菌外的7種供試菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，并且后者對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑制作用強(qiáng)于前者。結(jié)論 湖南產(chǎn)石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油的成分和抑菌活性均有較大差異，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)加以區(qū)分。

石菖蒲；水菖蒲；揮發(fā)油；抑菌活性；GC-MS

菖蒲為天南星科菖蒲屬植物，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，民間常用其防病祛疫［1］。在我國(guó)資源豐富，迄今已發(fā)現(xiàn)7個(gè)品種和2個(gè)變種，分別是水菖蒲、石菖蒲、長(zhǎng)苞菖蒲、金錢蒲、茴香菖蒲、香葉菖蒲、寬葉菖蒲、細(xì)根菖蒲 （水菖蒲變種）及金邊菖蒲 （石菖蒲變種）［2］，歷代本草［3-4］主要以水菖蒲和石菖蒲為藥材來源?，F(xiàn)代研究表明，兩者富含揮發(fā)油，具有多種生物活性，尤其是在抑菌作用方面［5-8］。湖南是石菖蒲和水菖蒲的主產(chǎn)地之一，但這兩種藥材中揮發(fā)油成分的差異較大［9-10］，本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 （GC-MS）技術(shù)分析其成分組成，并通過平皿打孔和數(shù)學(xué)級(jí)試管稀釋法測(cè)定其體外抑菌活性，為合理利用和開發(fā)湖南產(chǎn)菖蒲屬植物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料 GCMSQP2010 GC-MS聯(lián)用儀（日本島津公司）；SW-CJ-1B超凈工作臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備有限公司）；WAC-47全自動(dòng)高壓滅菌鍋 （北京勤業(yè)永為科技有限公司）；303-0S型電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上?？德穬x器設(shè)備有限公司）。

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂 （肉湯）培養(yǎng)基 （杭州微生物試劑有限公司）；無菌脫纖維羊血 （北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；明膠十六烷三甲基溴化胺培養(yǎng)基 （上海源葉生物科技有限公司）。乙酸乙酯、無水硫酸鈉等均為分析純。

石菖蒲和水菖蒲于2012年11月采自湖南瀏陽大圍山，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定為天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott和水菖蒲Acorus calamus L.。將這兩種藥材洗凈，除去泥砂，取根莖，陰干，備用。

金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、綠膿桿菌ATCC27853、表皮葡萄球菌ATCC1228、痢疾志賀氏桿菌ATCC25931、白假絲酵母菌ATCC10231和乙型溶血性鏈球菌ATCC32210均購(gòu)自南京便診生物科技有限公司；幽門螺桿菌由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院范學(xué)工教授贈(zèng)送。

1.2 揮發(fā)油提取 將石菖蒲和水菖蒲藥材粉碎成粗粉，分別稱取200 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加6倍量蒸餾水浸泡2 h，自冷凝管上端加水至充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，加熱至沸，保持微沸6 h，冷卻后收集揮發(fā)油，即得。石菖蒲揮發(fā)油為無色透明油狀物，收率1.8%；水菖蒲揮發(fā)油為淡黃色透明油狀物，收率2.1%，分別用無水硫酸鈉脫水，密封保存。

1.3 GC-MS分析條件［11］

1.3.1 氣相色譜條件 RTX-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 m，0.25μm）；采用柱程序升溫，初始溫度為60℃，以4℃/min的速率升至220℃，保持5 min，再以10℃/min的速率升至240℃；進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為氦氣（純度99.999%）；柱內(nèi)載氣體積流量1.0 mL/min；柱前壓130.0 kPa；分流比30∶1；進(jìn)樣量1μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 EI離子源；電子能量70 eV；掃描范圍35～550 amu；離子源溫度200℃；接口溫度260℃；倍增器電壓1.0 kV。

1.4 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1 供試品溶液制備 取石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油適量，加入DMSO，無菌水溶解，即得質(zhì)量濃度為100 mg/mL的供試品溶液（DMSO終濃度為0.5%）。

1.4.2 培養(yǎng)基制備 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂 （肉湯）培養(yǎng)基用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌和痢疾志賀氏桿菌；往里另加入8%脫纖維羊血用于培養(yǎng)乙型溶血性鏈球菌；Skirrow血瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)幽門螺桿菌；明膠十六烷三甲基溴化胺培養(yǎng)基用于培養(yǎng)綠膿桿菌；沙堡氏培養(yǎng)基用于培養(yǎng)白假絲酵母菌。

1.4.3 抑菌活性測(cè)定 采用改良打孔法［12］，分別定量移取供試液50μL，DMSO溶液為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)6次。細(xì)菌在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（幽門螺桿菌用37℃微需氧環(huán)境 ［85%N2、10%CO2、5%O2］中培養(yǎng)72 h），真菌在28℃下培養(yǎng)48 h后，測(cè)量抑菌圈兩個(gè)垂直方向的直徑，以評(píng)價(jià)不同樣品的抑菌活性。然后，采用數(shù)學(xué)級(jí)試管稀釋法測(cè)定揮發(fā)油的MIC，每管液體培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的揮發(fā)油，使其終濃度分別為0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2和0.1 mg/mL，各管最終總?cè)萘繛? m L。另設(shè)加等量不含任何藥物的M-H液體培養(yǎng)基作為正常對(duì)照，含菌不含藥的M-H液體培養(yǎng)基作為陽性對(duì)照。各實(shí)驗(yàn)管中分別加入濃度為2×107cfu/mL的各菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期新鮮培養(yǎng)物0.1 mL，同法培養(yǎng)后，以培養(yǎng)基中沒有細(xì)菌生長(zhǎng)的最高稀釋度為MIC，確定抑菌濃度范圍。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 揮發(fā)油成分分析 按上述實(shí)驗(yàn)條件對(duì)石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，樣品總離子流圖見圖1和圖2，再采用面積歸一化法測(cè)定各成分的相對(duì)含有量，各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索及人工解析質(zhì)譜，并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖［13-14］比對(duì)。結(jié)果，從石菖蒲揮發(fā)油中分離得到51個(gè)色譜峰，鑒定出41個(gè)化合物，占揮發(fā)油總量的99.50%，主要為甲基胡椒酚 （45.06%）、順式異丁香酚甲醚（35.51%）、β-細(xì)辛醚 （9.38%）、長(zhǎng)葉松烯 （1.50%）等；從水菖蒲揮發(fā)油中分離得到71個(gè)色譜峰，鑒定出46個(gè)化合物，占揮發(fā)油總量的93.98%，主要為β-細(xì)辛醚（16.58%）、藍(lán)桉醇 （14.38%）、水菖蒲酮 （10.81%）、去羥基異菖蒲烯二醇 （9.33%）、9-柏烷酮 （8.07%）、喇叭烯氧化物 （6.99%）、1-異丙基-4，8-二甲基螺 ［4.5］癸-8-烯-7-酮 （4.58%）等，詳見表1。

圖1 石菖蒲揮發(fā)油總離子流圖

圖2 水菖蒲揮發(fā)油總離子流圖

表1 湖南菖蒲屬植物揮發(fā)油的成分分析

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 揮發(fā)油抑菌活性 石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油對(duì)上述8種供試菌的抑菌圈直徑存在很大差異，抑菌活性結(jié)果見表2，MIC值見表3。

表2 石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油的抑菌活性比較 （抑菌圈直徑，n=6）

表3 石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油抑菌的M IC值

由表2可知，石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油均對(duì)除綠膿桿菌外的7種供試菌株表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，但抑菌能力和范圍存在差異。兩者對(duì)革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用均明顯強(qiáng)于革蘭

陰性菌大腸埃希菌和痢疾桿菌，對(duì)幽門螺桿菌和白假絲酵母菌也均有較強(qiáng)的抑制作用，但對(duì)大腸埃希菌和痢疾志賀氏桿菌的抑菌活性均較弱。其中，后者對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用明顯強(qiáng)于前者 （P＜0.05）。

由表3可知，石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油對(duì)這7種供試菌株的MIC在0.3～0.8 mg/mL之間。其中，兩者對(duì)大腸埃希菌、痢疾志賀氏桿菌、白假絲酵母菌和幽門螺桿菌的MIC均分別為0.80、0.80、0.50和0.40 mg/m L，并且后者對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌（MIC分別為0.40、0.30和0.30 mg/mL）的抑制作用強(qiáng)于前者（MIC分別為0.50、0.40和0.40 mg/mL）。

3 討論

在植物形態(tài)方面，石菖蒲葉自根莖叢生，無中脈，而水菖蒲植物體較大，根莖比石菖蒲粗，葉有明顯的中脈；在藥材性狀方面，石菖蒲粗節(jié)似蜈蚣，扁曲分枝色灰棕，氣香油點(diǎn)環(huán)鮮明，而水菖蒲根莖粗壯少分枝，斷面海綿筋脈點(diǎn)，濃烈異香帶泥腥［15-16］；在化學(xué)成分方面，比較表1中石菖蒲和水菖蒲揮發(fā)油成分的組成，發(fā)現(xiàn)兩者差異較大；在抑菌活性方面，雖然兩者對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、幽門螺桿菌、白假絲酵母菌、大腸埃希菌和痢疾桿菌均表現(xiàn)出抑菌活性，但后者對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用強(qiáng)于前者。綜上所述，石菖蒲和水菖蒲在植物形態(tài)、藥材性狀、化學(xué)成分和抑菌活性等方面均有明顯不同，因此，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)加以區(qū)分。

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R284.1

B

1001-1528（2015）12-2778-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.048

2015-02-25

湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目 （201577）；湖南省教育廳項(xiàng)目 （15C0114）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局 “藥用植物學(xué)”重點(diǎn)學(xué)科課題（國(guó)中醫(yī)藥發(fā) ［2009］30號(hào)）；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目 （湘教通 ［2010］212號(hào)）

李 娟（1979—），女，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幬镔|(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。E-mail：forever_lijuan@163.com

*通信作者：李順祥 （1964—），男，教授，研究方向?yàn)橹兴幱行С煞峙c資源研究。E-mail：455792859@qq.com