VEGF165b和VEGF165在胃癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

關(guān)云艷，諸靜芬，歐希龍，吳海榮，吳錫平，王倩

（1.江蘇省無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 無(wú)錫 214071；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中大醫(yī)院，消化內(nèi)科，江蘇 南京 210009）

·臨床論著·

VEGF165b和VEGF165在胃癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

關(guān)云艷1，諸靜芬1，歐希龍2，吳海榮1，吳錫平1，王倩1

（1.江蘇省無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 無(wú)錫 214071；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中大醫(yī)院，消化內(nèi)科，江蘇 南京 210009）

目的研究VEGF165b和VEGF165在胃癌及癌旁正常組織中的表達(dá)及胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA與預(yù)后的關(guān)系。方法分別應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌及癌旁正常組織中VEGF165b和VEGF165的基因及蛋白表達(dá)，并對(duì)患者進(jìn)行2年的隨訪，比較VEGF165b mRNA/ VEGF165 mRNA比值及這兩種蛋白表達(dá)水平在胃癌及癌旁組織中的變化；同時(shí)分析VEGF165b與VEGF165蛋白表達(dá)的相關(guān)性以及胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果在胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA低于癌旁正常組織中的水平；在癌旁正常組織中VEGF165b基因及蛋白表達(dá)強(qiáng)于VEGF165，在胃癌組織中VEGF165b基因及蛋白的表達(dá)則低于VEGF165，而且兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；此外，在兩年內(nèi)死亡的患者中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA明顯低于生存患者中的比值水平。結(jié)論與正常組織相比，胃癌組織中存在VEGF165b向VEGF165基因及蛋白水平上的優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)換，這種變化有望成為治療胃癌的新靶點(diǎn)。

VEGF165b；VEGF165；實(shí)時(shí)RT-PCR；免疫組織化學(xué)；胃癌

目前已知腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管的形成，而這一過(guò)程主要是由于促血管生成因子和抑制因子調(diào)控失衡，促血管生成因子增多所致。其中作用最強(qiáng)的就是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），但近年來(lái)研究結(jié)果顯示并不是所有的VEGF變構(gòu)體都有此作用，其新型剪接變構(gòu)體-VEGFxxxb則具有抑制血管形成的作用。由于VEGF165在VEGF-A中所占比例最高，且生物活性最強(qiáng)，故在臨床和實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣，相應(yīng)地VEGF165b也就受到頗多關(guān)注。為此，該研究應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR、免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)胃癌及癌旁正常組織中VEGF165b、VEGF165基因及蛋白的表達(dá)情況的變化；并分析這兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性以及VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA與預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1材料與試劑

選取東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院2009年9月-2010年9月進(jìn)行手術(shù)的胃癌患者48例。所有患者均有完整的臨床及病理資料，術(shù)前均未行化療或其他針對(duì)腫瘤的治療，癌旁正常組織是取距離癌組織5 cm以上的外觀正常的組織。其中男34例，女14例；年齡25～79歲，平均（59.08±11.63）歲。病變直徑≥5 cm者28例，＜5 cm者20例。根據(jù)TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期4例，Ⅱ期16例，Ⅲ期26例，Ⅳ期2例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的35例，無(wú)轉(zhuǎn)移的13例；侵犯血管形成癌栓者29例，未侵犯血管者19例；病理類型顯示腺癌分別為35例，腺鱗癌2例，鱗癌3例，印戒細(xì)胞癌8例。

熒光定量PCR試劑盒（SYBRGreen）購(gòu)于TaKaRa公司，引物由南京凱基生物公司合成，VEGF165、 VEGF165b一抗均購(gòu)自英國(guó)abcam公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物工程技術(shù)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)胃癌及癌旁正常組織中VEGF165b mRNA、VEGF165 mRNA的表達(dá)以Trizol提取標(biāo)本中總RNA，取RNA樣品用1×TE Buffer稀釋樣品100倍，測(cè)定樣品在260nm和280 nm的吸收值確定RNA的質(zhì)量。按以下計(jì)算RNA的濃度=A260×稀釋倍數(shù)×0.04μg/μl，A260/280在1.8～2.1視為抽提的RNA的純度很高。然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，接著進(jìn)行熒光定量PCR，以cDNA為模板，表1顯示序列為引物，反應(yīng)體系（20μl）：2×Realltime PCR Master Mix（SYBRGreen）10μl+模板（cDNA稀釋10倍）1μl+引物MIX（F/R各為10μmol）2μl+DEPC 7μl。反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃15 s，63℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.2免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃癌組織及癌旁正常組織中VEGF165b、VEGF165蛋白的表達(dá)所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4μmol的連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)胃癌手術(shù)標(biāo)本的腫瘤組織和癌旁正常組織中VEGF165和VEGF165b的表達(dá)。應(yīng)用微波爐恒溫抗原修復(fù)后滴加相應(yīng)一抗（1∶100），孵育過(guò)夜后滴加二抗（1∶500）及DAB顯色，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照組，已知結(jié)腸癌陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照組。以細(xì)胞結(jié)構(gòu)中存在粗細(xì)一致的棕黃色顆粒為陽(yáng)性，其中VEGF165b和VEGF165陽(yáng)性顆粒均分布于細(xì)胞胞漿。雙盲法隨機(jī)觀察5個(gè)不同高倍視野，各計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)量及染色強(qiáng)度分為陰性（-），無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞染色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%；弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性細(xì)胞在10%～25%之間；中度陽(yáng)性（++），陽(yáng)性細(xì)胞25%～75%；強(qiáng)陽(yáng)性

（+++）,陽(yáng)性細(xì)胞＞75%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胃癌及癌旁正常組織中VEGF165b mRNA、VEGF165 mRNA的表達(dá)

胃癌組織中VEGF165 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（5.363±2.499）高于癌旁正常組織（1.899±0.759），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。VEGF165b mRNA在胃癌組織中表達(dá)的相對(duì)量是（1.549± 0.5819），低于在癌旁正常組織表達(dá)的相對(duì)量（2.960±1.043），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而且VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA這一比值在癌旁正常組織中高于胃癌組織（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 VEGF165b mRNA and VEGF165 mRNA在胃癌及癌旁正常組織中的差異性表達(dá)

2.2VEGF165b和VEGF165蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)

在胃癌組織中VEGF165b和VEGF165表達(dá)的陽(yáng)性率分別為27.08%和64.58%，在癌旁正常組織中VEGF165b和VEGF165表達(dá)的陽(yáng)性率分別為75.00%和39.58%。VEGF165b和VEGF165在胃癌及癌旁組織中表達(dá)程度不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在胃癌組織中VEGF165b表達(dá)低于VEGF165（見(jiàn)圖2B和圖3B），而在癌旁正常組織中VEGF165b表達(dá)則強(qiáng)于VEGF165（見(jiàn)圖2A和圖3A）。

圖2 VEGF165b的表達(dá)

圖3 VEGF165的表達(dá)

2.3VEGF165b和VEGF165蛋白表達(dá)的相關(guān)性

胃癌及癌旁組織標(biāo)本共96例，兩者間表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（P=0.0064，Pearson系數(shù)=0.3808）。見(jiàn)表2。

表2 VEGF165和VEGF165b表達(dá)的相關(guān)關(guān)系

2.4胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA的比值與預(yù)后的關(guān)系

在兩年的隨訪中，有3例失訪，45例中有16例死亡。兩年死亡率35.6%。胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA在生存組中為（0.415± 0.271），死亡組中為（0.26±0.135），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.53，P=0.016）。

3 討論

在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中VEGF165起著至關(guān)重要的作用，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制除促進(jìn)血管形成以外，對(duì)某些體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞也有直接的促增殖作用[1-2]，并能增加腫瘤對(duì)化學(xué)藥物的抗藥性[3]。2002年BATES等[4]分離出血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-A的新型剪接變構(gòu)體－VEGF165b，選擇性剪接發(fā)生于外顯子8的遠(yuǎn)端，在結(jié)構(gòu)上與VEGF165相比，僅表現(xiàn)為終末6個(gè)氨基酸的不同，VEGF165b與VEGFR-2的

親和力等同于VEGF165，但僅能微弱而短暫地激活VEGFR2及其下游信號(hào)分子，從而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制VEGF165生物學(xué)作用的發(fā)揮，起到抑制VEGF165所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管舒張、血管生成的作用。隨后研究人員也證實(shí)VEGF xxxb這一抑制性剪接變構(gòu)體家族的存在。VEGF165b多存在于正常細(xì)胞、組織及血液循環(huán)中，尤其在具有高水壓傳導(dǎo)性的組織如脈絡(luò)叢以及腎小囊足細(xì)胞表達(dá)較高[5]，在腎細(xì)胞癌、前列腺癌中表達(dá)均下調(diào)。后來(lái)PRITCHARD-JONES等[6]研究顯示，在正常表皮和一部分惡性黑色素瘤的標(biāo)本中有VEGF165b的表達(dá)，但在腫瘤標(biāo)本中表達(dá)微弱；而且與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤相比，在隨后發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中VEGF165b表達(dá)明顯減少，而周圍正常組織的VEGF165b表達(dá)沒(méi)有變化。RENNEL[7]用裸鼠構(gòu)建結(jié)腸癌模型，隨后以重組VEGF165b蛋白腹腔內(nèi)注射，結(jié)果顯示VEGF165b重組蛋白抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

目前，為止發(fā)現(xiàn)在腎細(xì)胞癌[4]、前列腺癌[4]、惡性黑色素瘤[6]、食管癌[8]、結(jié)直腸癌[9]中表達(dá)均下調(diào)，但在膀胱癌中表達(dá)情況尚有爭(zhēng)議，DAS等[10]研究顯示在膀胱移行細(xì)胞癌中VEGF165b表達(dá)上調(diào)，也有VEGF165b在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)的報(bào)道[11]。目前，這方面研究?jī)H限于上述腫瘤，尚無(wú)VEGF165b在胃癌中表達(dá)情況的研究，而筆者通過(guò)應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR及免疫組織化學(xué)方法證實(shí)VEGF165b基因及蛋白在癌旁正常組織中表達(dá)高，在胃癌組織中表達(dá)降低，VEGF165的表達(dá)情況正好相反；此外，胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA低于癌旁正常組織中的比值，這一比值下降程度越明顯，預(yù)后就越差，而且這兩種蛋白表達(dá)程度呈負(fù)相關(guān)性。由此認(rèn)為，在胃癌組織中也存在VEGF165b向VEGF165的剪接優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)換，因此控制這種剪接轉(zhuǎn)換或補(bǔ)充外源性VEGF165b有望成為治療胃癌的關(guān)鍵。NOWAK等[12]研究一些細(xì)胞內(nèi)剪接因子及細(xì)胞外生長(zhǎng)因子對(duì)該選擇性剪接的影響，結(jié)果顯示SRp55、TGF-β1可上調(diào)VEGF165b基因及蛋白的表達(dá)，抑制p38 MAPK途徑則降低后者所誘導(dǎo)的遠(yuǎn)端選擇性剪接的發(fā)生。CIURA等[13]報(bào)道丁酸鹽可以上調(diào)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFxxxb基因的表達(dá)水平，同時(shí)也伴隨著相應(yīng)蛋白的增加。以上結(jié)果還僅限于體外實(shí)驗(yàn)，如果能在體內(nèi)控制VEGF mRNA的剪接模式，將會(huì)有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，這也是以后的研究方向。

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（張蕾 編輯）

Expressions of VEGF165b and VEGF165 in gastric carcinoma and their correlations with prognosis*

Yun-yan GUAN1,Jing-fen ZHU1,Xi-long OU2,Hai-rong WU1,Xi-ping WU1,Qian WANG1
(1.Department of Gastroenterology,Wuxi Traditional Chinese Medicine Hospital,Wuxi,Jiangsu 214071,P.R.China;2.Department of Gastroenterology,the Affiliated Zhongda Hospital, Clinical Medical College,Southeast University,Nanjing,Jiangsu 210009,P.R.China)

【Objective】To investigate the expressions of VEGF165b and VEGF165 mRNA and proteins in gastric carcinoma and the adjacent normal tissue,and to investigate the correlation between the ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA in gastric carcinoma and the patients'prognosis.【Methods】The expressions of VEGF165b mRNA and VEGF165 mRNA in gastric carcinoma and the adjacent normal tissue were measured by RT-PCR and the expressions of VEGF165b and VEGF165 proteins were examined by immunohistochemistry.The relationships between the ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA and the patients'prognosis were determined.【Results】The ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA in the gastric carcinoma was lower than that in the adjacent normal tissue.The expressions of VEGF165b mRNA and protein were higher than those of VEGF165 in the normal tissue.However,the expressions of VEGF165b mRNA and protein were lower than those of VEGF165 in the gastric carcinoma tissue.There was a negative correlation between the protein expressions of VEGF165b and VEGF165.Furthermore,the ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA in the patients who were dead in two years was lower than that of the survivals.

VEGF165b;VEGF165;RT-PCR;immunohistochemistry;gastric carcinoma

R735.2

A

1005-8982（2015）27-0041-04

2015-05-26

無(wú)錫市科技局資助課題（No：CSE00907）

【Conclusions】Compared with the normal tissue,there is a predominant conversion from VEGF165b to VEGF165 in both mRNA and protein levels in gastric carcinoma,which can be a new target for treating gastric carcinoma.