樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞對人體影響的實驗研究

張洪超

（黑龍江省醫(yī)院普外一科，黑龍江 哈爾濱 150300）

·臨床論著·

樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞對人體影響的實驗研究

張洪超

（黑龍江省醫(yī)院普外一科，黑龍江 哈爾濱 150300）

目的探究樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞（DC-CIK）細胞輸注對胰腺腫瘤患者的影響。方法對30例經(jīng)病理證實的胰腺腫瘤患者輸注自體DC-CIK細胞，每例均在輸注前、后抽取血液，應用流式細胞技術測量T細胞亞群和CD4+CD25+CD127low調節(jié)性T細胞（Treg）的改變；ELISA法測量IFN-γ和IL-4數(shù)值的變化。結果患者輸注后外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+T細胞含量增加，CD4+/CD8+含量增加，CD8+T細胞含量減少（P＜0.01）；CD4+CD25+CD127lowTreg減少（P＜0.01）；Th1細胞因子IFN-γ含量較輸注前增加，而Th2細胞因子IL-4含量減少（P＜0.01）。結論DC-CIK細胞輸注可以改善胰腺腫瘤患者的免疫機能，加強人體的抗腫瘤免疫應答，是治療胰腺腫瘤患者的一個方法。

樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞；胰腺腫瘤；T淋巴細胞

生物治療已經(jīng)成為一個新的常規(guī)抗腫瘤療法，也為晚期不適合手術或者承受不住其他療法的患者開辟了一個新的治療途徑。胰腺腫瘤是常見的消化系惡性腫瘤。初期無明顯癥狀，當出現(xiàn)黃疸或疼痛時為時已晚，或有遠處轉移，或腫瘤已固定不能切除，治療困難。即使可以手術治療，因該手術損傷大且易復發(fā)，術后需配合化療，患者機體承受打擊大，免疫力明顯降低，這時，生物治療是這一患者可以采取的

有效治療措施，甚至首選治療措施。樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞（dendritic cells-cytokine induced killer cells，DC-CIK）是近些年發(fā)展起來的新型高效的生物活性細胞，國內外已廣泛開展治療癌癥方面的科研和臨床治療[1-2]?，F(xiàn)在報道證實，經(jīng)過手術或化療的患者免疫機能下降，給予DC-CIK細胞治療可以讓患者在治療腫瘤的同時，免疫機能得到提高，在提高繼續(xù)接受治療的能力和提高患者生存質量方面都有重要意義[3]。不過，在胰腺腫瘤治療方面的文獻不多，本文通過免疫指標的測量，對給患者輸注DC-CIK細胞前后指標的量化對比，觀察DCCIK細胞生物治療對胰腺腫瘤患者的作用。

1 資料與方法

1.1研究對象

選取普外科2010年5月-2012年12月收治的胰腺腫瘤患者共30例。其中男18例，女12例，年齡40～70歲。全部患者都是胰腺腫瘤確診病例，全部病例按國際抗腫瘤聯(lián)盟（UICC）標準給予分期（TNM分期），Ⅰ～Ⅱ期9例，Ⅲ期12名，Ⅳ期9例。全部患者卡氏評分≥60分，心、腎、肝臟功能均正常。所有均是根治手術后患者，術后給予采自自身的DC-CIK細胞輸注，全部患者在輸注DC-CIK細胞前，醫(yī)生都與家屬及患者本人進行溝通，本人及家屬均表示同意，并簽字。

1.2主要試劑

rhINF-γ購自上?？寺∩锛夹g公司，抗人CD3單克隆抗體購自eBioscience公司，人rhIL-4、rhIL-2、rhIL-1a、rhGM-CSF購自PeproTech公司，F(xiàn)icoll液、人無血清培養(yǎng)基AIM-V購自美國GIB-CO公司，F(xiàn)ITC標記鼠抗人CD3、CD127單克隆抗體、PE標記鼠抗人CD8、CD4、CD56單克隆抗體、PE-Cy5標記鼠抗人CD25單克隆抗體和同型對照IgGα1購自美國BD公司，人IFN-γ、IL-4酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自晶美生物工程有限公司，rhGMCSF（注射用重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子）購自廈門特寶生物工程股份有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1樹突狀細胞的制備所有操作嚴格遵守標準程序。采集患者外周血2×109～3×109個單個核細胞及血漿80 ml（Kabi Fresenius，German）。經(jīng)Ficoll Hypaque（Gibco，USA）分離單個核細胞后，離心洗滌重懸，調整細胞濃度為2×106～4×106個/ml鋪入6孔板，培養(yǎng)箱中孵育2 h后，收集懸浮細胞至另一個50 ml離心管繼續(xù)培養(yǎng)；第3天補加樹突狀細胞（dendritic cells，DC）培養(yǎng)液；第5天加入腫瘤特異性抗原（終濃度為20～80μg/ml），誘導后12～16 h加入腫瘤壞死因子（TNF-α，500 U/ml）；第8天收集細胞，離心，洗滌，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸，總體積為100 ml，靜脈回輸患者，共4次，回輸時間選擇在2次DC回輸之間。

1.3.2細胞因子誘導的殺傷細胞制備將經(jīng)Ficoll Hypaque（Gibco，USA）分離的單個核細胞重懸于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，以2×106個/ml鋪入培養(yǎng)瓶，補加γ-干擾素（INF-γ，1 000 U/ml），置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育；次日補加CD3單抗（0.5μg/ml）及白細胞介素-2（IL-2，1 000 U/ml）繼續(xù)培養(yǎng)；第3天用10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液進行補液；第11～12天收集細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer，CIK）細胞，離心，生理鹽水洗滌3次。用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸，總體積為100 ml，經(jīng)靜脈回輸患者，共4次，回輸時間選擇在2次DC回輸之間。

1.3.3DC-CIK回輸后效果分析如果輸入DC-CIK后患者有發(fā)熱等不舒服的感覺，各項化驗有一定的改變，且對患者的生活有嚴重的影響，這些是評價的指標。

1.3.4患者血液中免疫指標細胞對采集及分析在回輸DC-CIK之前7 d抽取患者血液，并于輸注DC -CIK細胞后14 d再次抽取血液，經(jīng)過處理后，分別加入管中，小管中加入血液及相應的抗體，血液加100μl，抗體量為10μl，抗體分別是CD3-FITC、CD127-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、CD25-PE-Cy5，用IgGα1做相應的對照，2者經(jīng)過反應后，時間是15 min，反應后再次經(jīng)過處理，上儀器檢測，檢測后行記錄數(shù)據(jù)分析總結。

1.3.5檢測Th1/Th2按前述回輸DC-CIK之前7 d抽取患者血液，并于輸注DC-CIK細胞后14 d再次抽取血液，經(jīng)過離心等處理后，留取患者血清，置入冰箱低溫冷凍備用。取ELISA試劑盒，按操作程序測定IFN-γ與IL-4血清中的含量，操作務求規(guī)范嚴密。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，實驗設計為自體配對均數(shù)的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1效果及副反應

總體上，DC-CIK注入人體后，多數(shù)患者狀態(tài)有明顯改善，進食增加、精力恢復、乏力倦怠癥狀消失，其中有個例患者有暫時的體溫升高現(xiàn)象，均未超過39℃，時間較短，應用藥物后，體溫下降至正常，并沒有反復，全部患者無皮疹瘙癢等不良癥狀，各項化驗指標也未見顯著變化。

2.2患者免疫指標評價

DC-CIK注入人體后，患者CD3+、CD4+百分比增加，CD8+百分比下降，CD4+/CD8+數(shù)值提高；標志CD3+CD56+細胞數(shù)量提升；標志CD127lowTreg CD25+CD4+細胞比例下降，相比注入CIK-DC細胞前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 患者輸注前后T淋巴細胞表面標記的變化（%，n=30）

2.3細胞因子比較

CIK-DC細胞輸注組IFN-γ含量提高，IL-4含量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 患者輸注前后外周血細胞因子IFN-γ和IL-4的比較（pg/ml，n=30）

3 討論

胰腺癌是消化道常見腫瘤，惡性程度高，治療困難，晚期放化療都難以延長生存期，臨床及科研都在多方探索有效的療法。治療的主要難度在于復發(fā)和轉移，手術前治療重點在局部，術后治療重點在于全身，近年開展的生物治療是有希望的全身治療辦法。

自身防御機制在抗腫瘤過程中發(fā)揮著不可替代的作用，T細胞在自身防御的過程中發(fā)揮著重要作用，癌癥之所以能發(fā)生、發(fā)展，在于機體免疫狀態(tài)有了問題，導致免疫監(jiān)視減弱，正常狀態(tài)下，人體免疫細胞量和功能都協(xié)調一致，能夠發(fā)揮正常的免疫機制，當這種平衡被打破，免疫功能在一定程度上的缺失，至使腫瘤產生免疫逃逸。實驗證明，DC-CIK的輸注可以改善患者的免疫狀態(tài)，是一種有效的支持治療。患者免疫狀態(tài)的改善對患者的無病生存期及帶瘤生存期的延長都有一個良好的預期。DC細胞是啟動、調控和維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。通過體外活化培養(yǎng)負載腫瘤抗原的DC細胞，當細胞數(shù)量達到一定數(shù)量后回輸給患者，可誘導機體產生強烈的抗腫瘤免疫反應[4]。最新研究顯示，DC細胞與CIK細胞共培養(yǎng)后，提高細胞的增殖速度和殺傷活性，且使其對腫瘤細胞的殺傷作用更具特異性。對于血液、消化、呼吸等多個系統(tǒng)腫瘤細胞均有殺傷作用。CIK細胞最初是指在正常人體外周血中只占1%～5%的CD3+CD56+的T淋巴細胞，目前國內外制備的用于過繼免疫治療的CIK細胞，實際上是體外擴增以CD3+CD56+、CD3+CD8+為主的異質性細胞群[5]。該細胞群具有廣泛的非MHC限制的極強的溶瘤活性。CIK增殖能力強，細胞毒作用強，對腫瘤細胞的識別能力很強，能精確“點射”腫瘤細胞，但不會傷及“無辜”的正常細胞。能消除殘留微小的轉移病灶，對手術后或放化療后患者效果顯著，因此，CIK細胞被認為是新一代的腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。

本文結果表明經(jīng)過以往的治療后，機體的免疫力受到不同程度的打擊和抑制，有些已不能進行下一步治療。經(jīng)過DC-CIK細胞的提取和輸注后，CD3+、CD4+含量和CD4+/CD8+數(shù)值升高，共表達CD3+CD56+細胞含量顯著提高。CIK細胞對腫瘤細胞有直接的殺傷，在體內受某些淋巴因子作用后，CIK細胞大量釋放具有細胞毒性的胞漿顆粒到胞外，這些顆粒直接破壞瘤細胞，進入體內活化的DC-CIK細胞分泌多種細胞因子，如干擾素γ、TNF-α和IL-2等，不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用，而且還可通過調節(jié)免疫系統(tǒng)間接殺傷腫瘤細胞。

1995年SAKAGUCHI等人首先提出CD4+CD25+Treg，引起免疫界越來越多的關注。CD4+CD25+Treg細胞可以維持自身免疫耐受，由于腫瘤抗原是自身抗原量或質的改變，因此，可以推測CD4+CD25+Treg細胞可以抑制腫瘤免疫的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)無論癌癥患者還是腫瘤動物模型，其外周CD4+CD25+Treg細

胞數(shù)量及功能均不同程度地增高，與患者死亡率增加，存活率降低密切相關。去除CD4+CD25+Treg細胞，利于誘導對多種腫瘤抗原的免疫應答，證明CD4+CD25+Treg細胞可以抑制體內抗腫瘤免疫反應。因此，CD4+CD25+Treg細胞可能在腫瘤逃逸、促進腫瘤的生長中發(fā)揮重要作用，也可能是腫瘤疫苗和免疫增強劑難以奏效的原因。

文獻顯示CD4+CD25+CD127lowTreg是人體自有的，可以識別身體內被激活的T淋巴細胞[6]，對Treg尤其可以區(qū)別，其特異性在目前發(fā)現(xiàn)的細胞標志中可以說是高的，而這種技術的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)在臨床中得到應用，效果良好。應用流式細胞術三色標記法檢測患者血液里CD4+CD25+CD127lowTreg含量，可以對Treg在血液中的含量反映得更精準。上述研究檢測DC-CIK細胞輸注前后血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量，可以看出胰腺腫瘤患者輸注DC-CIK前血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量較多。DC-CIK細胞輸注2星期，患者血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量減少。因而，CIK細胞以減少Treg含量的方式增強患者的免疫功能。

人體的免疫結構中，細胞因子有著重要的地位。從產生細胞因子和其功能作用的區(qū)別，細胞可區(qū)分為Th1細胞與Th2細胞。Th1的細胞作用是使人免疫力更強，這類細胞可以分泌諸如IFN-γ、IL-2等因子；Th2細胞分泌諸如IL-4、IL-10等因子，在體液免疫中發(fā)揮關鍵效能。健康狀態(tài)下，人體處在一個免疫平衡狀態(tài)，Th1、Th2分別分泌增強免疫和抑制免疫的因子[7]，互相制衡。腫瘤患者疾病的開始及進展均有Th1參與的免疫機能伴隨。上述通過檢測兩類細胞因子在血液中的含量，可以看出輸注DC-CIK細胞的患者，IFN-γ含量增加，IL-4含量減少。顯示DC-CIK細胞輸注在一定程度上影響著Th1/Th2的平衡，保持人體免疫狀態(tài)的平衡，促進免疫系統(tǒng)對腫瘤的免疫反應。

總之，DC-CIK細胞輸注對增強胰腺腫瘤患者T淋巴細胞生理效能，減少患者血液中Treg的含量，同時使Th1/Th2的比例保守一個相對穩(wěn)定的水平起到關鍵作用。但是，上述論述所涉范圍有限，DC-CIK細胞對胰腺腫瘤患者更深層次的作用及效果還有待揭示。

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（張蕾 編輯）

Effect of dendritic cell-cytokine induced killer cells on human pancreatic cancer

Hong-chao ZHANG
(The First Department of General Surgery,Heilongjiang Provincial Hospital, Harbin,Heilongjiang 150300,P.R.China)

【Objective】To study the effect of dendritic cell-cytokine induced killer cells(DC-CIK)immunotherapy on immunity function of patients of pancreatic cancer.【Methods】A total of 30 patients with pathologically confirmed pancreatic cancer were treated with DC-CIK cell therapy.The levels of T cell subsets and CD4+CD25+CD127 low regulatory T cells were detected with flow cytometry and the IFN-γ and IL-4 were detected with ELISA in peripheral blood before and after treatment.【Results】The T cell subsets CD3+,CD4+and CD3+CD56+,and the ratio of CD4+/CD8+were increased after DC-CIK cell transfusion while the CD8+cell subset and CD4+CD25+CD127 low regulatory T cells were significantly decreased(P＜0.01).The level of IFN-γ was increased and the level of IL-4 decreased at the same time(P＜0.01).【Conclusions】DC-CIK cell immunotherapy can improve the immune function of patients with pancreatic cancer and enhance the anti-tumor effects,so it is one of means which can be used to treat patients with pancreatic cancer.

dendritic cell-cytokine induced killer cell;pancreatic cancer;T lymphocyte

R735.9

A

1005-8982（2015）27-0032-04

2015-03-14