PD-1抑制劑對小鼠肺組織炎癥微環(huán)境及損傷的影響*

曹麗，吳碧波，周開艷，耿一超，劉凌楓，王剛，曠華香，盧冰，蘇勝發(fā)

550004 貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科;550004 貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 腫瘤科

藥物治療在惡性腫瘤的治療中占有重要地位，化療、靶向治療和內(nèi)分泌治療已在惡性腫瘤的治療中應(yīng)用多年。近年來，以程序性死亡受體1(programmed death 1, PD-1)抑制劑為代表的免疫檢測點抑制劑，也已成為惡性腫瘤的主要治療方法之一，提高了腫瘤治療療效。

PD-1抑制劑通過阻斷T細胞上PD-1受體與其配體PD-L1的結(jié)合，活化T細胞，增強T細胞對腫瘤的免疫應(yīng)答，而發(fā)揮抗腫瘤作用。同時，PD-1 抑制劑也會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過度激活，引起機體各系統(tǒng)組織產(chǎn)生免疫相關(guān)不良反應(yīng)(immune-related adverse event,irAE)，包括皮膚反應(yīng)、免疫性肺炎、免疫性心肌炎、免疫性肝炎、免疫性腸炎、甚至神經(jīng)系統(tǒng)炎癥等[1]。隨著PD-1抑制劑臨床應(yīng)用的推廣，irAE日益受到重視。

Nishino等[2]對20項PD-1抑制劑臨床試驗，包括黑色素瘤、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、腎癌等4 496例病例進行Meta分析發(fā)現(xiàn)，免疫性肺炎的發(fā)生率約2.7%，3級及以上肺炎發(fā)生率為0.8%。免疫性肺炎的發(fā)生率雖然較低，但嚴重的irAE以免疫性肺炎更為常見，導(dǎo)致治療中斷甚至危及生命[3]。有文獻報道，在真實世界中免疫性肺炎的發(fā)生率可高達20%，3級及以上肺炎發(fā)生率為3.4%[4-5]。探索免疫性肺炎的發(fā)病機制，對免疫性肺炎的防治具有重要的臨床意義。鑒于臨床上獲取組織標(biāo)本研究免疫性肺炎困難，本研究擬采用小鼠模型觀察PD-1抑制劑對肺組織炎癥微環(huán)境及損傷的影響，初步探索其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備及試劑

Navios流式細胞儀(中國廣州流式生物科技有限公司)、多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，PD-1抑制劑(InVivoMAb anti-mouse PD-1，Bio X cell Co. Ltd. USA BE0146)、同種型對照IgG抗體(InVivoMAb anti-mouse IgG2a isotype control，Bio X cell Co.Ltd.USA BE0085)、兔抗鼠CD3、CD4、CD8抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(武漢賽維爾生物科技有限公司)，多因子(包含 IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α、TGF-β1、IFN-γ因子)檢測試劑盒(美國BioLegend公司)、羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，HE染色及Masson染色試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 動物分組及處理

15只健康狀況良好的C57BL/6小鼠，月齡6～8周，體重20～25 g，各種反射正常，養(yǎng)殖于貴州醫(yī)科大學(xué)SPF級動物基地[合格證號:SCXK(黔)2018-0001]，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食及飲水，清潔舒適環(huán)境(溫度：23～25℃，濕度：45%～55%)。隨機分為3組，每組5只；A 組為正常對照組，B 組為IgG組，C 組為PD-1抑制劑組。用藥劑量參考文獻給予[6-7]，PD-1抑制劑給藥方法：第1、2、3周每周給予PD-1抑制劑200 μg+1 mL生理鹽水腹腔注射，隨后每周給予PD-1抑制劑100 μg+1 mL生理鹽水腹腔注射，連續(xù)3周；IgG給藥方法：給藥時間點、劑量與給藥途徑同PD-1抑制劑；A組在相同的時間點，通過相同途徑給予等量的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集及處理

給藥后第7周用6%水合氯醛麻醉處死各組小鼠，取出肺組織，將左肺組織分為兩部分。一部分用10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，按3 μm厚度切片，用于HE、Masson及免疫組化染色；另一部分用于羥脯氨酸含量測定和流式細胞術(shù)檢測，剩下的肺組織保存至-80°超低溫冰箱保存。

1.4 HE染色

常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染液染3～5 min，水洗、分化液分化、水洗、返藍液返藍、沖洗后85%、95%的梯度酒精脫水各5 min，伊紅染液染色5 min，無水乙醇脫水透明后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)及病理變化，每張標(biāo)本隨機選取5個不重復(fù)視野。

1.5 Masson染色

按照產(chǎn)品說明書進行染色。光學(xué)顯微鏡下觀察，經(jīng)Masson染色后小鼠肺泡上皮細胞被染為紅色，膠原纖維被染為藍色。采用ImageJ圖像分析軟件進行膠原半定量分析，計算肺組織膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction,CVF)，CVF=視野中膠原面積/視野總面積，每張標(biāo)本隨機選取5個不重復(fù)視野。

1.6 免疫組化染色

石蠟切片脫蠟至水，置于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫室溫孵育25 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗后滴加3%牛血清白蛋白室溫封閉30 min。然后滴加對應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。過夜后PBS洗凈，滴加對應(yīng)的二抗，室溫孵育50 min。PBS洗凈后滴加DAB顯色液染色3 min，染色結(jié)束后進行蘇木素復(fù)染3 min左右，最后將切片脫水透明、中性樹膠封片。經(jīng)染色后細胞核為藍色，陰性對照以PBS代替一抗，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。鏡下采圖，每張切片隨機選取5個視野,采用ImageJ圖像分析軟件對肺組織切片進行分析,求得每個視野下CD3、CD4、CD8著色的平均光密度值(average optical density，AOD),AOD=累積光密度值/組織面積。

1.7 羥脯氨酸含量測定

稱取小鼠肺組織濕重30 mg放入試管中，剪碎加入水解液1 mL、95℃加蓋水浴水解20 min，按照試劑盒步驟依次進行操作。羥脯氨酸含量(μg/mg濕重)=(測定管OD值-空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5 μg/mL)×水解液總體積(mL)/組織濕重(mg)。

1.8 流式細胞術(shù)檢測肺組織細胞因子水平

稱取小鼠肺組織濕重20 mg，加入PBS 200 μL、苯甲基磺酰氟100 μL，冰上剪碎裂解，勻漿后離心取上清。按照LEGENDplexTMMouse B cell Panel Standard Cocktail，Lyophilized細胞因子檢測試劑盒說明書進行操作。取肺組織上清25 μL放入EP管，加入預(yù)混Beads及Assay Buffer各25 μL，常溫避光孵育2 h，離心棄上清，加入200 μL Wash buffer，離心棄上清，加入檢測抗體25 μL，常溫避光孵育1 h，加入SA-PE 25 μL，避光孵育30 min，離心棄上清，加入200 μL Wash buffer，離心棄上清，最后每管加入300 μL 1×Wash buffer，上機檢測TGF-β1、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-17A等細胞因子。數(shù)據(jù)用LEGEND plex v8.0軟件進行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用最小顯著差法，方差不齊時采用Dunnett’s T3方法。P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織的病理學(xué)觀察

2.1.1 HE染色 A組和B組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁纖細，肺泡間隔纖細，肺間質(zhì)無水腫，C組肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)水腫，可見較多的炎癥細胞浸潤(圖1)。

圖1 各組肺組織損傷情況(HE染色,×400)

2.1.2 Masson染色評估肺組織纖維化情況及膠原半定量分析 Masson染色膠原纖維被染為藍色。A組和B組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)未見明顯的膠原纖維沉積；C組肺組織正常結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔增厚，可見藍染的膠原纖維沉積(圖2)。肺組織膠原半定量分析結(jié)果顯示： A、B、C各組的CVF分別為4.30%±1.06%、5.10%±1.37%、10.70%±2.83%，組間比較發(fā)現(xiàn)A、B兩組CVF無明顯差異，而C組CVF較A組和B組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖3A)。

圖2 各組肺組織纖維化情況(Masson染色,×200)

2.2 肺組織羥脯氨酸含量測定

A、B、C各組羥脯氨酸含量分別為(0.116±0.090) μg/mg、(0.120±0.013) μg/mg、(0.160±0.013) μg/mg，A組和B組的羥脯氨酸含量相似，C組羥脯氨酸含量較A、B兩組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖3B)。

圖3 膠原半定量分析和羥脯氨酸含量測定

2.3 CD3、CD4及CD8免疫組化染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CD3+、CD4+、CD8+細胞染成棕黃色或棕褐色，C組的CD3+細胞浸潤增加，且以CD8+細胞為主，而A、B組中浸潤的CD3+細胞無明顯差別，CD4+細胞浸潤在A、B、C三組中相似(圖4)。 與A組相比，B組CD3標(biāo)記AOD值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.194，P=0.848)，而C組CD3標(biāo)記的AOD值較A組(t=5.267，P<0.01)和B組增加(t=5.066，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。A組與B組CD8標(biāo)記的AOD值相似(t=0.182，P=0.856)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而C組CD8標(biāo)記的AOD值較A組(t=7.818，P<0.01)和B組(t=7.636，P<0.01)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 A組、B組和C組CD4標(biāo)記的AOD值相似(t=0.245，P=0.784)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

圖4 免疫組化顯示肺組織淋巴細胞浸潤情況

表1 各組肺組織中CD3、CD4及CD8標(biāo)記的AOD計數(shù)結(jié)果

2.4 肺組織中細胞因子表達情況

2.4.1 IL-6表達情況 A、B、C組IL-6濃度分別為(13.55±3.45) pg/mL、(12.25±3.25) pg/mL、(35.65±6.13) pg/mL。A組與B組的濃度相似(t=0.460，P=0.654)，C組高于A組(t=7.809，P<0.01)和B組(t=8.269，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5A)。

2.4.2 TGF-β1表達情況 A、B、C組TGF-β1濃度分別為(322.50±23.44) pg/mL、(419.33±66.91) pg/mL、(1 019.77±104.17) pg/mL，各組TGF-β1變化趨勢與IL-6相似。A組與B組TGF-β1表達的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.017，P=0.067)，C組TGF-β1仍明顯高于A組(t=15.068，P<0.01)和B組(t=13.050，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5B)。

2.4.3 IL-4、IL-17A、TNF-α、IFN-γ表達情況 各組IL-4、IL-17A、TNF-α、IFN-γ表達水平均較低，低于設(shè)定的檢測范圍(IL-4<4.05 pg/mL，TNF-α<4.35 pg/mL，IL-17A<6.21 pg/mL，IFN-γ<5.74 pg/mL)。

圖5 肺組織中IL-6和TGF-β1的表達情況

2.5 小鼠一般狀況及體重變化

各組小鼠精神狀態(tài)、食欲良好，活動正常，至觀察時間點各組小鼠均存活。至觀察終點A、B、C各組小鼠體重分別為(26.39±3.84)g、(25.47±4.60)g、(27.80±2.64)g，體重變化的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.732，P=0.187；圖6)。

圖6 各組小鼠體重變化

3 討 論

藥物治療在惡性腫瘤的治療中起著舉足輕重的作用，部分抗腫瘤藥物可以導(dǎo)致肺損傷。化療藥物中，博來霉素的肺毒性較為常見，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)非特異性肺炎和肺纖維化，甚至迅速死于肺纖維化，而其機制尚不完全清楚[8]。多西他賽廣泛用于治療多種實體腫瘤，也可導(dǎo)致罕見且嚴重的間質(zhì)性肺炎，可能與I型和IV型超敏反應(yīng)相關(guān)[9]。分子靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)間質(zhì)性肺炎的發(fā)生率約5%[10]。PD-1抑制劑可活化T淋巴細胞，導(dǎo)致免疫性肺損傷，有文獻報道其發(fā)生率約3%～4%[2,11]。

本研究觀察了PD-1抑制劑對小鼠肺損傷的影響，并從免疫微環(huán)境的角度初探其潛在機制。組織病理觀察發(fā)現(xiàn)PD-1抑制劑導(dǎo)致小鼠肺泡間隔水腫、增厚，炎癥細胞浸潤，肺間質(zhì)膠原纖維沉積增多，羥脯氨酸含量增高，表明PD-1抑制劑可導(dǎo)致的小鼠肺損傷和纖維化。大多數(shù)臨床研究數(shù)據(jù)也顯示，PD-1抑制劑所致免疫性肺炎的發(fā)生率較低(3%～5%)，3級及以上肺炎僅約1%[2,11-12]。在臨床上PD-1抑制劑單藥治療NSCLC的臨床療效并不理想，整體有效率僅約20%～30%，聯(lián)合靶向、化療或放療的綜合模式能夠進一步提高療效[13-14]。PD-1抑制劑單獨使用時肺炎發(fā)生率雖然較低，需要注意的是PD-1抑制劑聯(lián)合其它治療方式可能增加肺損傷的風(fēng)險，應(yīng)當(dāng)引起重視。Oshima等[10]報道，EGFR-TKI聯(lián)合PD-1抑制劑(nivolumab)時間質(zhì)性肺炎的發(fā)生率高達25.7%，EGFR-TKI聯(lián)合nivolumab時發(fā)生間質(zhì)性肺炎的風(fēng)險比單獨使用nivolumab增加5.32倍。放射性肺損傷的本質(zhì)是淋巴細胞性肺泡炎，PD-1抑制劑可活化T淋巴細胞，故PD-1抑制劑與放療聯(lián)合應(yīng)用時也有加重放射性肺損傷的風(fēng)險[15-16]。

PD-1抑制劑主要通過活化T淋巴細胞介導(dǎo)免疫性損傷，免疫炎癥微環(huán)境在PD-1抑制劑所致肺損傷中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PD-1抑制劑組的肺組織中CD3+T淋巴細胞浸潤顯著增多。進一步分析發(fā)現(xiàn)，主要是肺組織中浸潤的CD8+T淋巴細胞增加，CD4+T淋巴細胞浸潤不明顯。本研究結(jié)果提示，CD8+T淋巴細胞浸潤，而不是CD4+T淋巴細胞在PD-1抑制劑所致肺損傷中起著重要作用。Laubli等[17]報道黑色素瘤患者使用PD-1抑制劑后誘發(fā)免疫性心肌炎，患者出現(xiàn)嚴重急性左心衰，進行心肌活檢，也發(fā)現(xiàn)心肌組織中大量CD8+細胞浸潤，經(jīng)皮質(zhì)類固醇激素治療后迅速好轉(zhuǎn)。這些研究結(jié)果表明，CD8+T淋巴細胞在PD-1抑制劑所致正常組織的免疫損傷中起著關(guān)鍵作用。同時，CD8+T淋巴細胞在抗腫瘤作用中也起著重要的作用，封閉CD8+T細胞雖可減輕PD-1抑制劑的免疫損傷，但勢必對其抗腫瘤作用帶來負面影響[18-19]。不同的T淋巴亞群，包括Th1、Th2、Th17、Treg細胞等，在不同原因?qū)е碌姆螕p傷中起著相應(yīng)作用[20-24]。本研究僅初步探索了CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞浸潤的情況，進一步深入研究起關(guān)鍵作用的T淋巴細胞亞群或更有助于精準(zhǔn)防控PD-1抑制劑所致肺損傷。

細胞因子是免疫炎癥微環(huán)境的重要構(gòu)成部分，在肺損傷中起重要作用。本研究檢測了IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α、TGF-β1、IFN-γ因子表達水平，發(fā)現(xiàn)PD-1抑制劑使肺組織中IL-6和TGF-β1表達水平顯著升高，表明IL-6和TGF-β1在PD-1抑制劑所致肺損傷及纖維化中扮演著重要角色。IL-6和TGF-β1都是重要的促炎和促纖維化因子，在感染和組織損傷的早期有利于組織修復(fù)，但過度或持續(xù)的產(chǎn)生會使生理性修復(fù)轉(zhuǎn)向過度的病理修復(fù)，其特征是纖維化形成[25-26]。研究表明，IL-6與TGF-β1對調(diào)控CD4+T細胞分化向Th17細胞分化是必不可少的，同時IL-6也抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Treg細胞分化[27-28]。Th17/Treg平衡的上調(diào)被認為是免疫耐受破壞的原因，與自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病的發(fā)生有關(guān)[29]。Tabata等[30]發(fā)現(xiàn)阻斷IL-6信號通路，可抑制肺成纖維細胞活化，改善小鼠放射性肺纖維化程度。IL-6受體阻斷劑可用于緩解腫瘤患者免疫治療導(dǎo)致的炎癥綜合征，并能緩解類固醇激素難治的PD-1抑制劑相關(guān)irAEs[31-32]。目前，阻斷TGF-β1介導(dǎo)的信號通路來減輕肺纖維化是研究的熱點。臨床上使用吡非尼酮延緩特發(fā)性肺纖維化的進展，吡非尼酮可通過抑制TGF-β1的關(guān)鍵信號通路，調(diào)控人成纖維細胞的增殖和向肌成纖維細胞的分化，減輕肺纖維化[33-34]。Macitentan能減輕TGF-β1誘導(dǎo)的肺纖維化和肺動脈高壓的發(fā)展過程[35]?，F(xiàn)實條件下，阻斷IL-6和TGF-β1的相關(guān)通路可能是減輕PD-1抑制劑所致肺損傷的簡便、快捷的有效方法，值得進一步探索。Kowalski等[36]發(fā)現(xiàn)，與健康人群比較，免疫檢測點抑制劑相關(guān)肺炎患者肺泡灌洗液中的IL-4、IL-17α、TNF-α及IFN-γ表達水平無明顯變化。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠給予PD-1抑制劑處理后，肺組織中IL-4、IL-17α、TNF-α及IFN-γ表達無明顯變化。結(jié)合臨床與動物實驗的結(jié)果，表明IL-4、IL-17α、TNF-α及IFN-γ在免疫檢測點抑制劑所致肺損傷中的作用輕微。

綜上所述，PD-1抑制劑可導(dǎo)致肺損傷，尤其是與其它抗腫瘤方式聯(lián)用時，應(yīng)當(dāng)重視肺損傷的風(fēng)險增加。CD8+而不是CD4+T淋巴細胞在PD-1抑制劑所致的肺損傷中起著重要作用，關(guān)鍵的T細胞亞群值得進一步探索。IL-6和TGF-β1扮演著重要角色，阻斷IL-6和TGF-β1的相關(guān)通路可能有助于減輕PD-1抑制劑所致肺損傷。更為深入地研究PD-1抑制劑導(dǎo)致肺損傷的免疫微環(huán)境調(diào)控機制，對精準(zhǔn)防治PD-1抑制劑所致肺損傷具有重要意義。

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