矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷對(duì)人巨核細(xì)胞株Dami增殖分化的影響

任 婧，鄧秀娟，王燕燕，張莉珂，牙甫禮，盧敏琪，張 擎，楊 燕,*

（1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510080；2.廣東省營(yíng)養(yǎng)膳食與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；3.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275）

矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷對(duì)人巨核細(xì)胞株Dami增殖分化的影響

任 婧1,2，鄧秀娟1,2，王燕燕1,2，張莉珂1,2，牙甫禮1,2，盧敏琪1，張 擎3，楊 燕1,2,*

（1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510080；2.廣東省營(yíng)養(yǎng)膳食與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；3.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275）

目的：研究植物花色苷單體矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy-3-g）對(duì)人巨核細(xì)胞株Dami的增殖、分化作用。方法：不同濃度的花色苷Cy-3-g（0.05、0.50、5.00、50.00、100.00 μmol/L）與人巨核細(xì)胞株Dami細(xì)胞共同培養(yǎng)，并將用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)巨核細(xì)胞活性、噻唑藍(lán)（methyl thiazo lyl tetrazolium，MTT）染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，軟瓊脂細(xì)胞集落培養(yǎng)法觀察巨核細(xì)胞集落生成情況。采用Giemsa染色法觀察細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨核細(xì)胞DNA多倍體的生成及細(xì)胞表面CD41陽(yáng)性表達(dá)率。結(jié)果：與對(duì)照組相比，50.00、100.00 μmol/L的Cy-3-g可增強(qiáng)Dami細(xì)胞活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各Cy-3-g劑量組與對(duì)照組相比，均可明顯增強(qiáng)Dami細(xì)胞增殖能力（P＜0.01）；Dami細(xì)胞集落數(shù)目、DNA多倍體數(shù)目以及CD41的陽(yáng)性表達(dá)率在50.00、100.00 μmol/L Cy-3-g作用下明顯升高，且與對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。結(jié)論：Cy-3-g能夠明顯促進(jìn)人巨核細(xì)胞株Dami的增殖、分化，這可以為花色苷促進(jìn)血小板生成提供可能的理論依據(jù)。

矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷；巨核細(xì)胞；增殖；分化

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康與生命，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為心血管疾病中一種常見(jiàn)的血管病變已成為CVD疾病死亡的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，血小板參與AS的發(fā)生、發(fā)展和斑塊形成等過(guò)程，尤其在動(dòng)脈粥樣硬化灶破損后，會(huì)引發(fā)大量的血小板黏附與聚集，進(jìn)而導(dǎo)致血管閉塞和血栓性疾病，如心肌梗塞和腦梗塞，已經(jīng)成為人類(lèi)健康的第一殺手[1]。因此，對(duì)血小板黏附與聚集的深入研究不僅有利于出血性疾病的診斷治療，對(duì)血栓性疾病的診治也起著重要的促進(jìn)作用。大量研究表明，植物性食物具有廣泛的促進(jìn)健康和預(yù)防心血管疾病的作用[2]?；ㄉ帐侵参锘瘜W(xué)物中一類(lèi)重要的黃酮類(lèi)化合物，常以糖苷的形式存在，是自然界中廣泛存在于植物中的水溶性天然色素?；ㄉ詹煌潭鹊卮嬖谟诖蟛糠种参锘ò旰凸麑?shí)種皮中，其中以深色漿果如葡萄、越橘、藍(lán)莓、桑葚，有色薯類(lèi)如紫番薯，谷物如高梁、紫玉米和黑米中含量尤為豐富[3]。

近年來(lái)大量的研究以及本課題組的研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)膳食花色苷的攝入可以抑制AS發(fā)展以及抑制血小板的激活和血栓形成[4-6]。近期本課題組的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，花色苷單體可以促進(jìn)活化血小板凋亡，且其能夠通過(guò)調(diào)控Bcl-2家族中凋亡/抗凋亡蛋白水平來(lái)促進(jìn)活化血小板凋亡[7-8]。血小板凋亡后必然會(huì)引起血小板數(shù)目的減少，繼而延長(zhǎng)機(jī)體凝血時(shí)間。但是前期的研究結(jié)果顯示，花色苷并未引起小鼠出血時(shí)間的延長(zhǎng)[6]。而血小板主要來(lái)源于巨核細(xì)胞，那么花色苷是否可以通過(guò)促進(jìn)機(jī)體巨核細(xì)胞增殖分化而增加血小板生成來(lái)維持血小板數(shù)目穩(wěn)定呢？因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外研究花色苷單體矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy-3-g）對(duì)人巨核細(xì)胞株Dami的增殖分化作用，從而為花色苷調(diào)控巨核細(xì)胞的功能以及血小板的生成提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Dami細(xì)胞由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張擎教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

Cy-3-g（純度為99.9%） 挪威Polyphenol AS公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Gibco公司；雙抗（青霉素、鏈霉素）美國(guó)Thermo公司；臺(tái)盼藍(lán) 加拿大BioBasic有限責(zé)任公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 廣州艾斯金生物科技有限公司；β-巰基乙醇 美國(guó)Amresco公司；姬姆薩（Giemsa）色素 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉 日本廣野公司；人血小板生成素（human thrombopoietin，TPO） 美國(guó)PeproTech公司；CD41-FITC 美國(guó)BioLegend公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料、RNA酶 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；FACS Calibar流式細(xì)胞儀（配有Cell Quest軟件） 美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

RPMI-1640培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%雙抗配成完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、95%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)人巨核細(xì)胞株Dami，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。Cy-3-g粉末溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，使儲(chǔ)備液濃度為100 mmol/L，取100 μL分裝后存放于－80 ℃冰箱中，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。細(xì)胞分組：按Cy-3-g濃度分為0.05、0.50、5.00、50.00、100.00 μmol/L 5 組與Dami細(xì)胞共同培養(yǎng)，將完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。

1.3.2 臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性

將按照1.3.1節(jié)方法常規(guī)培養(yǎng)2 d的各組細(xì)胞懸液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液按體積比9∶1混合后，滴入計(jì)數(shù)板。靜置 1 min，使懸浮細(xì)胞下沉，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。按照下式計(jì)算活細(xì)胞比例。

1.3.3 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后按5×104個(gè)/mL的密度接種于96 孔板中，每孔體積200 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后離心，棄去上清液，每孔加入20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微量振蕩儀上振蕩5 min，于酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.4 細(xì)胞集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

取無(wú)菌離心管5 支，按體積分?jǐn)?shù)依次加入60% RPMI-1640培養(yǎng)基、10% β-巰基乙醇（10 mmol/L）、10% FBS、10%各組細(xì)胞懸液（調(diào)整細(xì)胞密度為104個(gè)/mL）、50 ng/mL TPO，混勻后在37 ℃條件下預(yù)熱。取預(yù)熱的瓊脂迅速按10%體積分?jǐn)?shù)加入到各組細(xì)胞懸液中，混勻后接種于3.5 cm培養(yǎng)皿上。數(shù)十分鐘后待其凝固，放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)[9]。5 d后取出，在顯微鏡下觀察細(xì)胞集落生長(zhǎng)情況（細(xì)胞集落生成越多、越大，表明細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)），每個(gè)培養(yǎng)皿底以“米”字等分為8 份，每份中選取兩個(gè)視野，記錄每組集落數(shù)目之和，大于或等于10 個(gè)細(xì)胞記為一個(gè)集落。

1.3.5 細(xì)胞Giemsa染色實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2 d后取各組細(xì)胞涂于載玻片上。待自然晾干后，于甲醇中固定5 min，然后在Giemsa染色液中浸染20 min，流水沖洗后晾干，中性樹(shù)膠封固并在顯微鏡下觀察，選取每張載玻片的4 個(gè)頂角及載玻片中間共5 個(gè)視野拍照。

1.3.6 流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞DNA多倍體

收集常規(guī)培養(yǎng)2 d的各組細(xì)胞于潔凈的EP管中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。細(xì)胞固定15 min后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇通透細(xì)胞1 h，洗滌細(xì)胞兩次，取100 μL細(xì)胞懸液于流式細(xì)胞上樣管中，加入RNA酶，37 ℃條件下孵育20 min，再加入PI染料（對(duì)照組不加），避光作用20 min后每管加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）至500 μL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA濃度分析其多倍體生成情況[10]。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞表面CD41含量

流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞樣本收集同1.3.6節(jié)，細(xì)胞洗滌兩次后取100 μL細(xì)胞懸液于流式細(xì)胞上樣管中，分別加入流式抗體CD41-FITC，每組設(shè)兩個(gè)平行樣并設(shè)IgG同型對(duì)照組。細(xì)胞與抗體避光孵育15 min后，每管加入400 μL PBS，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)其表達(dá)情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，數(shù)值采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以表示。多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間的比較采用t檢驗(yàn)分析。采用Graphpad Prism 5軟件制作統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cy-3-g對(duì)人巨核細(xì)胞株Dami活性的影響

圖1 Cy-3-g對(duì)人巨核細(xì)胞株Dami細(xì)胞活性的影響Fig. 1 Effect of Cy-3-g on viability of megakaryocytic cells

各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，計(jì)算其活細(xì)胞比例。由圖1可知，50.00、100.00 μmol/L花色苷Cy-3-g與細(xì)胞共同培養(yǎng)后，活細(xì)胞比例達(dá)到98.07%和99.25%，與對(duì)照組（88.10%）相比，細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.05），但0.05、0.50、5.00 μmol/L花色苷Cy-3-g對(duì)細(xì)胞活性的影響與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 Cy-3-g對(duì)人巨核細(xì)胞株增殖能力的影響

MTT法檢測(cè)Cy-3-g對(duì)Dami細(xì)胞增殖能力的影響，如圖2所示，各濃度Cy-3-g均可明顯增強(qiáng)Dami細(xì)胞的增殖能力，且與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖2 MTT法檢測(cè)Cy-3-g對(duì)Dami細(xì)胞的增殖作用Fig.2 Proliferation effect of Cy-3-g on Dami cells tested by MTT

2.3 Cy-3-g對(duì)Dami巨核細(xì)胞集落生成的影響

圖3 Cy-3-g對(duì)Dami巨核細(xì)胞集落生成的影響Fig.3 Effect of Cy-3-g on colony formation of Dami cells

Dami巨核細(xì)胞集落培養(yǎng)結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，50.00、100.00 μmol/L Cy-3-g共同培養(yǎng)的細(xì)胞集落生成數(shù)目≥30 個(gè)（圖3B），明顯高于對(duì)照組≤10 個(gè)（圖3A）（其他劑量組圖片未列出），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但0.05、0.50、5.00 μmol/L Cy-3-g劑量組的細(xì)胞集落生成數(shù)目與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3C）。

2.4 Cy-3-g對(duì)Dami細(xì)胞DNA多倍體生成的影響

圖4 Cy-3-g對(duì)Dami巨核細(xì)胞多倍體的影響Fig.4 Effect of Cy-3-g on cell polyploidy of Dami cells

如圖4所示，對(duì)照組與0.05、0.50、5.00 μmol/L劑量花色苷共同孵育的細(xì)胞倍體多為2N，僅有少量呈多倍性（圖4A，0.05、0.50、5.00 μmol/L劑量組圖片未列出），計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)≥4N的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的8.38%，而50.00、100.00 μmol/L Cy-3-g與細(xì)胞共同培養(yǎng)后與對(duì)照相比，多核細(xì)胞明顯增多（圖4B）（P＜0.01），分別約占細(xì)胞總數(shù)的33.88%和26.44%（圖4C）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA多倍體數(shù)目結(jié)果顯示，與對(duì)照組（8.90%）（圖4D）相比，50.00 μmol/L Cy-3-g與細(xì)胞共同培養(yǎng)后＞8N細(xì)胞比例（32.30%）（圖4E）明顯增加（P＜0.01）。但0.05、 0.50、5.00 μmol/L劑量的花色苷對(duì)巨核細(xì)胞多倍體的影響與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4F）。

2.5 Cy-3-g對(duì)Dami巨核細(xì)胞表面CD41表達(dá)量的影響

圖5 Cy-3-g對(duì)Dami巨核細(xì)胞表面CD41表達(dá)率的影響Fig.5 Effect of Cy-3-g on CD41 expression rate on the surface of Dami cells

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD41陽(yáng)性表達(dá)率。如圖5所示，與對(duì)照組相比，高劑量花色苷（50.00、100.00 μmol/L）與細(xì)胞共同孵育后表面CD41表達(dá)率明顯增加（P＜0.01）。高劑量Cy-3-g可增加細(xì)胞成熟度，但0.05～5.00 μmol/L低劑量組與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5B）。

3 討 論

巨核細(xì)胞增殖分化是血小板產(chǎn)生的前提，巨核細(xì)胞經(jīng)過(guò)成熟、前血小板的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境作用等一系列過(guò)程后最終將血小板釋放到血液中[11]。促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化可以維持體內(nèi)血小板活化凋亡后數(shù)目的穩(wěn)定[12]。巨核細(xì)胞大小不一，直徑為12～120 μm，是體內(nèi)唯一可以進(jìn)行核內(nèi)有絲分裂的細(xì)胞，其細(xì)胞核的數(shù)目可以從2N、4N、8N、16N到32N，最多可達(dá)到128N甚至更多，隨著多倍體數(shù)目的增多，細(xì)胞的分化能力逐漸增強(qiáng)[13]。伴隨著細(xì)胞核的成熟，巨核細(xì)胞表面特異性的蛋白表達(dá)量可以反映巨核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成熟度。

Dami細(xì)胞是人源巨核系細(xì)胞株，它具有巨核細(xì)胞的基本特性，其表面含有大量與血小板相同的糖蛋白如CD41、CD61、CD42b等，其中CD41表達(dá)量最多，是研究人巨核細(xì)胞生理生化、分化成熟機(jī)理及其與血小板關(guān)系的理想模型[12,14]。本研究首次發(fā)現(xiàn)高濃度花色苷單體Cy-3-g（50.00、100.00 μmol/L）能明顯增強(qiáng)Dami細(xì)胞活性（圖1）；MTT法與細(xì)胞集落培養(yǎng)法的結(jié)果均表明細(xì)胞增殖能力在Cy-3-g作用下也明顯增強(qiáng)（圖2、3）；細(xì)胞Giemsa染色實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞DNA多倍體檢測(cè)結(jié)果分別定性、定量地說(shuō)明了細(xì)胞在Cy-3-g作用下分化能力顯著增強(qiáng)（圖4），與此同時(shí)細(xì)胞的成熟度也相應(yīng)增加（圖5）。因此，花色苷單體Cy-3-g能夠在體外有效促進(jìn)人巨核細(xì)胞的增殖分化。

目前關(guān)于植物性食物對(duì)于巨核細(xì)胞增殖分化的研究主要集中在中草藥中某些成分的作用方面，如地榆提取物總皂苷、腫節(jié)風(fēng)總黃酮等分別對(duì)巨核祖細(xì)胞和小鼠巨核細(xì)胞有明顯的增殖分化作用[15-16]。莫姝等[17]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖能夠有效刺激巨核細(xì)胞的增殖，可為血小板減少癥的輔助治療提供一定的理論依據(jù)。目前臨床上對(duì)于血小板減少癥主要采用促血小板生成素（TPO）進(jìn)行治療，雖然TPO能夠有效刺激巨核細(xì)胞的增殖分化并產(chǎn)生具有生理功能的血小板[18]，但是在臨床實(shí)驗(yàn)中也會(huì)對(duì)病人產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)，如誘發(fā)血栓以及不可逆骨髓網(wǎng)狀纖維增生等多種并發(fā)癥或后遺癥[19-20]。因而，探索并發(fā)現(xiàn)更多具有促血小板生成作用的功能性食物成分，如花色苷等植物化合物對(duì)疾病的預(yù)防與治療具有重要意義。

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Effect of Cyanidin-3-O-β-Glucoside on the Proliferation and Differentiation of Human Megakaryocytic Cell Line Dami

REN Jing1,2, DENG Xiujuan1,2, WANG Yanyan1,2, ZHANG Like1,2, YA Fuli1,2, LU Minqi1, ZHANG Qing3, YANG Yan1,2,*
(1. School of Public Health, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food, Nutrition and Health, Guangzhou 510080, China; 3. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

Purpose: To investigate the effects of cyanidin-3-O-β-glucoside (Cy-3-g) on the proliferation and differentiation of human megakaryocytes cell line (Dami). Methods: Megakaryocytes were cultured with or without different concentrations of Cy-3-g (0.05, 0.50, 5.00, 50.00 and 100.00 μmol/L). Cell viability and proliferation were respectively measured by typan blue staining and MTT test. Colony formation of megakaryocytes in soft agar medium from different groups was assayed. After culturing the cells from each group, giem sa staining was used to observe cell morphology. Polyploidy of megakaryocyte DNA and CD41 expression rate were tested by fl ow cytometry. Results: Cy-3-g at concentrations of 50.00 and 100.00 μmol/L effectively enhanced the viability of Dami cells when compared with the control group (P < 0.05). Dami cells treated with Cy-3-g showed higher cell proliferation than the cells from the control group (P < 0.01). Cy-3-g at 50.00 and 100.00 μmol/L signifi cantly increased the number of colony formation, DNA polyploidy and CD41 expression rate in Dami cells compared to the control group (all P < 0.01). Conclusion: Cy-3-g can promote the proliferation and differentiation of human megakaryocytes, which provides a potential theoretical basis for platelet production induced by anthocyanins.

cyanidin-3-O-β-glucoside; megakaryocyte; proliferation; differentiation

R151.41

A

1002-6630（2015）01-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201501037

2014-07-14

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81372978）；中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（KF201214）

任婧（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與慢性非傳染病的預(yù)防。E-mail：1988.renjing@163.com

*通信作者：楊燕（1972—），女，教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與慢性非傳染病的預(yù)防。E-mail：yangyan3@mail.sysu.edu.cn