木補對心肌缺血大鼠ST段及Omentin－1/iNOS和TGF－β1/JNK通路的影響

楊 雅，劉 霞

涼山州第二人民醫(yī)院（西昌 615000）

心肌缺血是由心臟血液灌注減少導致心臟供氧不足的一種病理狀態(tài)，其常見誘因為冠狀動脈阻塞、血液黏度增高、超氧陰離子和氧自由基引起的過氧化損傷等［1］。 木補即異葉澤蘭（Eupatorium heterophyllumDC.）［2］，多年生草本，甘苦微溫之品，澤蘭屬，主產于涼山州地區(qū)?！峨p柏彝醫(yī)書》及現代《云南中草藥》記載，木補為一種常用的活血化瘀中草藥，毒副作用小。資料［3］顯示，澤蘭的主要化學成分為迷迭香酸、熊果酸、齊墩果酸、胡蘿卜苷、原兒茶酸、乙酰熊果酸、咖啡酸和香茶菜素等酚酸類，具有擴張微血管、改善微循環(huán)、增加紅細胞流動性、拮抗血栓形成以及降低血液黏度等藥理作用，因而其可能成為一種新的治療心肌缺血的民族特色藥物。本研究通過觀察心肌缺血大鼠ST段改變及血清網膜素－1（Omentin－1）和血漿轉化生長因子β1（TGF－β1）相關指標的變化，探討彝藥木補對心肌缺血大鼠的治療作用，并采用 Western－blot法對心臟內JNK1/2和iNOS蛋白的表達進行檢測，旨在揭示彝藥木補治療心肌缺血大鼠的可能機制，以期為心肌缺血的防治提供新的中草藥依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠30只，雌雄兼用，月齡3個月，體質量250～300g，購自四川大學華西醫(yī)學中心實驗動物中心，合格證號：SCXK（川）2014～6。

1.2 實驗藥物及主要試劑儀器

彝藥木補購自涼山州中藥材有限責任公司；戊巴比妥鈉購自上海江萊生物科技有限公司；垂體后葉素（Pit）購自美國Promega公司；大鼠 Omentin－1 ELISA Kit購自 R＆D公司；大鼠 TGF－β1ELISA Kit購自美國GBD公司；牛血清白蛋白購自美國Sigma 公司；p－JNK1/2 兔源一抗購自美國NovusBiologicals公司；iNOS兔源一抗購自美國santacruz公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG購自北京博爾西科技有限公司；ELx酶標儀由美國Bio－Tek Instruments Inc公司生產；心電圖機由SCHILLER AG公司生產；旋轉蒸發(fā)儀由德國Heidolph生產；電泳儀和轉膜儀由上?？∈松锟萍加邢薰咎峁桓咚倮鋬鲭x心機由北京泰澤瑞達科技有限公司提供。

1.3 彝藥木補水煎劑的制備

準確稱取彝藥木補100g，雙蒸水浸泡，文火煎煮，多層紗布過濾，旋轉蒸發(fā)儀濃縮成1g生藥/mL，除菌后4℃保存。

1.4 分組給藥

將30只SD大鼠隨機分成正常對照組、心肌缺血模型組、木補低劑量組［0.8g生藥/（kg·d）］、木補中劑量組［2g生藥/（kg·d）］和木補高劑量組［4 g生藥/（kg·d）］。各給藥組大鼠灌服不同濃度的木補水煎劑，連續(xù)給藥6d，正常對照組及心肌缺血組灌服等量生理鹽水。

1.5 心肌缺血模型制備

各組大鼠干預處理6d后，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉（0.2mL/100g）麻醉。固定并記錄各組大鼠注射Pit前的心電圖，10min后除正常對照外其余各組大鼠尾靜脈注射Pit（1.5U/kg），正常對照組注射等量生理鹽水。記錄注射Pit后10min時各組大鼠的心電圖變化情況，計算注射Pit后10 min時各組心電圖ST段的上移幅度均值。

1.6 ELISA法檢測Omentin－1、TGF－β1的變化

各組大鼠于注射Pit后20min心臟采血，用于ELISA檢測。做3次生物學重復。

1.7 Western－blot法檢測iNOS和p－JNK1/2的表達

各組大鼠注射Pit后20min，取大鼠心臟。提取心臟總蛋白并定量后，進行SDS－PAGE電泳，電印跡轉移法轉膜，5%蛋白封閉液搖床封閉2h，4℃過夜孵育一抗（稀釋度1∶1 000），TBST洗膜6次；HRP標記的二抗（稀釋度1∶5 000）搖床孵育45 min，TBST洗膜6次，ECL法顯色、曝光，暗室洗片，并進行數據分析。做3次生物學重復。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件分析實驗數據，用均數±標準差（±s）表示，用t檢驗比較組間數據，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同劑量木補對心肌缺血大鼠模型心電圖的影響

心肌缺血模型組大鼠注射Pit后10min，ST段上移幅度為（0.67±0.03）mV，正常對照組ST段無變化，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低、中、高劑量木補連續(xù)灌服大鼠6d后，與心肌缺血模型組比較，中、高劑量木補均能顯著降低心肌缺血大鼠ST段上移幅度（P＜0.05）（表1）。

表1 不同劑量木補對心肌缺血大鼠ST段上移幅度的影響（mV）

2.2 不同劑量木補對心肌缺血大鼠Omentin－1、TGF－β1的影響

各組大鼠注射Pit后10min，心肌缺血模型組Omentin－1和TGF－β1分泌量分別為30.81ng·L－1和143.41ng·L－1，正常對照組 Omentin－1和 TGF－β1分泌量分別為67.13ng·L－1和71.74ng·L－1，兩組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低、中、高劑量木補連續(xù)灌服大鼠6d后，與心肌缺血模型組進行比較，高劑量木補能升高心肌缺血大鼠血清Omentin－1水平（P＜0.05）；中、高劑量木補能夠顯著降低心肌缺血大鼠血漿TGF－β1（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同劑量木補對心肌缺血大鼠Omentin－1、TGF－β1的影響

2.3 不同劑量木補對心肌缺血大鼠iNOS和p－JNK1/2蛋白表達的影響

各組大鼠注射Pit后10min，心肌缺血模型組大鼠JNK1/2磷酸化水平提高，iNOS表達水平降低，與正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；低、中、高劑量木補連續(xù)灌服大鼠6d后，與心肌缺血模型組比較，高劑量木補能顯著降低心肌缺血大鼠心臟JNK1/2的磷酸化水平（P＜0.05），也能顯著升高心肌缺血大鼠iNOS表達量（P＜0.05）（圖2）。

圖2 不同劑量木補對心肌缺血大鼠p－JNK1/2、iNOS蛋白表達的影響

3 討論

近年來臨床實踐［4］發(fā)現，中草藥可通過抑制化學趨化因子產生、調節(jié)轉化生長因子水平、提高血液NO分泌量以及促進相關脂肪因子表達等方式治療心肌缺血。彝藥木補的化學成分主要為酚酸類及三萜酸類化合物，能活血化瘀、擴張血管活性，對心血管疾病可能有較好的治愈作用?；诖?，本研究通過建立大鼠心肌缺血模型，以大鼠心電圖ST段改變及血液活性因子為研究指標，闡明彝藥木補的抗心肌缺血功效。冠狀動脈阻塞引起的心臟供血不足是導致ST段抬高的主要誘因，并可進一步演化為心肌損傷、心肌微循環(huán)障礙、心律失常以及心肌舒縮障礙等病理特征，其中ST段抬高是心肌缺血患者血液灌注異常的主要臨床表現［5］，因此及時監(jiān)測其心電圖ST段變化情況，合理降低其ST段上移幅度，可有效控制和治療疾病。本研究實驗結果顯示，尾靜脈注射Pit，模型組大鼠ST段抬高幅度顯著高于正常對照組，表明心肌缺血模型制備成功。給予中、高劑量彝藥木補預處理6d后，能顯著降低心肌缺血大鼠心電圖ST段抬高幅度，提示彝藥木補可改善心肌缺血大鼠心電圖體征，并控制其病程的惡化。為揭示彝藥木補降低心肌缺血大鼠心電圖ST段抬高幅度的可能機制，本研究擬以血清Omentin－1和血漿TGF－β1作為研究對象，分別對心肌缺血大鼠 Omentin－1/iNOS系統(tǒng)和 TGF－β1/JNK1/2通路進行探討。

Omentin即脂肪因子，是一種分泌蛋白，有Omentin－1和 Omentin－2兩種亞型，其中 Omentin－1可與血管內皮相應受體結合，激活體內iNOS蛋白活性，從而促進血管內NO產生，能改善血管內皮細胞功能、抑制血管鈣化形成、促進血管再生、恢復毛細血管密度活性，從而廣泛參與對心血管疾病的調控過程［6］。Zhong等［7］研究表明，冠狀動脈疾病患者Omentin－1水平較健康組低，與本實驗結果相符。本實驗結果顯示，高劑量木補可顯著提高心肌缺血大鼠Omentin－1分泌量、iNOS蛋白表達量，提示彝藥木補可通過調節(jié)心肌缺血大鼠Omentin－1分泌水平，進而刺激心臟iNOS蛋白表達，從而增加血液中NO的釋放量，清除超氧陰離子和過氧自由基，抑制NADPH氧化酶活性，減少氧化損傷，以改善心肌缺血癥狀。

TGF－β1是一種由血管內皮細胞、心肌細胞等分泌的具有廣泛生物學功能的生長因子，是調節(jié)細胞增殖、凋亡的重要因素［8］，它可能與心肌缺血等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有關。TGF－β1活化后可與細胞膜表面的二聚體受體結合，激活ⅳ型受體，磷酸化R－Smads分子C末端的絲氨酸殘基，傳導胞外信號，持續(xù)激活體內JNK活性，從而調控若干下游靶分子，不斷擴大信號級聯反應，促進心肌缺血損傷［9］。進一步對 TGF－β1介導的JNK1/2信號通路是否參與心肌缺血損傷進行探討，研究［10］表明，TGF－β1水平與心肌缺血等冠狀動脈疾病有關，可作為預測心肌缺血的重要臨床指標。同時Strand等［11］發(fā)現，體內JNK1/2的磷酸化對 TGF－β1的分泌具有正調控作用。本實驗結果顯示，彝藥木補預處理大鼠后，血漿TGF－β1分泌水平和體內JNK1/2的磷酸化程度均顯著降低，并呈現劑量依賴性，表明彝藥木補可通過抑制JNK1/2的磷酸化調節(jié)TGF－β1的分泌量，從而改善心肌缺血癥狀。

綜上所述，Pit介導的大鼠心電圖ST段抬高幅度的增加，可能與 Omentin－1和 TGF－β1的表達水平有關。彝藥木補可通過調節(jié)心肌缺血大鼠體內iNOS和JNK1/2蛋白活性，控制血清細胞因子的分泌，從而促進心肌缺血轉歸，但對彝藥木補改善心肌缺血作用的具體機制仍需進一步研究。

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