BikDD腫瘤靶向基因治療抑制淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)研究＊

曹 軍，羅 寧，李建璜△

1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 胸部?jī)?nèi)二科（長(zhǎng)沙 410013）；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 腫瘤科（長(zhǎng)沙 410008）

惡性淋巴瘤是危害人類健康的重要疾病之一，其主要治療方法為化學(xué)藥物治療和放射治療，但上述方法對(duì)于進(jìn)一步提高其生存率作用有限。隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，基因治療已成為淋巴瘤治療研究的熱點(diǎn)，并取得了較多的成果，但目的基因表達(dá)靶向性差及表達(dá)效率低是限制其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。本課題組成員前期研究已成功構(gòu)建出能在淋巴瘤細(xì)胞中高效特異性表達(dá)目的基因的S－VISA載體［1］，很好地解決了以上問(wèn)題。因而，如何選擇有效的治療基因成為淋巴瘤基因治療的關(guān)鍵。

細(xì)胞凋亡通路障礙是淋巴瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中最重要的分子事件之一，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為淋巴瘤基因治療的思路之一。Bcl－2家族包括凋亡抑制蛋白Bcl－2、Bcl－XL、Bcl－w、Mcl－1等，促凋亡蛋白質(zhì)如 Bik、Bad、Bax等［2］。Bik（Bcl－2interacting killer）作為Bcl－2家族中一種僅含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白質(zhì)，能結(jié)合的Bcl－2家族凋亡抑制蛋白最多，且與 Bcl－2及 Mcl－1的結(jié)合力最強(qiáng)［3］。既往研究［4－6］表明，將Bik的第33位蘇氨酸殘基和第35位絲氨酸殘基替換為門冬氨酸，使其成為突變型Bik（BikDD），BikDD在肺癌、乳腺癌及前列腺癌等惡性腫瘤中促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力比野生型Bik更強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建含BikDD、Survivin啟動(dòng)子及VISA系統(tǒng)的表達(dá)質(zhì)粒S－VISA－BikDD，將其轉(zhuǎn)染淋巴瘤細(xì)胞株，研究其在淋巴瘤細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 pGL3－Survivin質(zhì)粒由本科室唐友紅博士惠贈(zèng)［7］，pCMVgDWPRE質(zhì)粒由意大利帕爾馬大 學(xué) Dr Gaetano Donofrio 惠 贈(zèng)［8］，TSTA－NSN質(zhì)粒由美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校醫(yī)學(xué)院Dr Mike Carey惠 贈(zèng)［9］，pGL3－CMV、pGL3－Basic質(zhì) 粒 購(gòu) 自Promega公司。

1.1.2 細(xì)胞 人淋巴瘤 Ramos、U937、Raji細(xì)胞株購(gòu)自上海麥莎生物科技有限公司，人肝細(xì)胞株Chang Liver購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞所。

1.1.3 試劑 實(shí)驗(yàn)所用內(nèi)切酶均為NEB產(chǎn)品，連接酶（寶靈曼B.M 公司），DNA連接酶、luciferase assay system試劑盒（美國(guó)Promega公司）。新生小牛血清（杭州四季青生物公司），DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），質(zhì)粒小量提取試劑盒（美國(guó)Omega公司）、膠回收試劑盒（TaKaRa公司），基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖校ū淘铺焐锛夹g(shù)研究所），鼠抗人Bik單克隆抗體（臺(tái)灣Abnova公司）。

1.2 方法

1.2.1 pGL3－Bik載體的構(gòu)建 根據(jù) GenBank的Bik基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為：5＇CGAAGATCTATGTCTGAAGTAAGACC 3＇（包含起始密碼子，并在5＇端引入BgiⅡ酶切位點(diǎn)）；下游引物序列為：5＇CCAAGCTTTCACTTGAGCAGC AGGT 3＇（在5＇端引入 HindⅢ酶切位點(diǎn)），引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。Trizol法提取人類腸基因組RNA，以此為模板，PCR擴(kuò)增Bik基因，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃30s，53℃30 s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。用BgiⅡ/HindⅢ對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切后純化回收，連入同樣用BgiⅡ/HindⅢ雙酶切的pGL3－Basic載體，構(gòu)建成pGL3－Bik載體。利用PCR及 HindⅢ/BgiⅡ雙酶切鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司純化測(cè)序。

1.2.2 pGL3－BikDD 載體的構(gòu)建 根據(jù) GenBank的Bik基因序列，為實(shí)現(xiàn)將Bik基因編碼蛋白第33位蘇氨酸殘基和第35位絲氨酸殘基替換為門冬氨酸，對(duì)其編碼基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，分別將第33位蘇氨酸殘基編碼基因ACT突變?yōu)镚AC，第35位絲氨酸殘基編碼基因TCT突變?yōu)镚AT。引物設(shè)計(jì)如下：上游引物5＇GTTCTTGGCATGGACGAC GATGAAGAGGACC3＇，下游 引物 5＇GGTCCTCT TCATCGTCGTCCATGCCAAGAAC 3＇。以 pGL3－Bik質(zhì)粒為模板，對(duì)Bik基因編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min，95℃40s，60℃60s，68℃5min，18個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨卞抗性篩選后提取質(zhì)粒，KpnI/NheI酶切鑒定，進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)pGL3－BikDD構(gòu)建成功。

1.2.3 pGL3－CMV－BikDD載體的構(gòu)建 BgiⅡ和HindⅢ雙酶切pGL3－BikDD和pGL3－CMV載體，回收約500bp的BikDD片段和約5.4kb的pGL3－CMV載體片段。用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建成pGL3－CMV－BikDD載體。利用Bik引物進(jìn)行PCR篩選及雙酶切（BgiⅡ/HindⅢ）鑒定。

1.2.4 S－VISA－BikDD 載體的構(gòu)建 1）G5E4TBikDD－WPRE載體的構(gòu)建：BgiⅡ和HindⅢ雙酶切pGL3－BikDD和 G5E4T－WPRE載體，回收約500 bp的BikDD片段和約5.6kb的G5E4T－WPRE載體片段。用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建成G5E4TBikDD－WPRE過(guò)渡載體。利用Bik引物進(jìn)行PCR篩選和雙酶切（BgiⅡ/HindⅢ）鑒定。2）S－VISABikDD載體的構(gòu)建：KpnI和SalI雙酶切S－TSTA和G5E4T－BikDD－WPRE載體，回收約4.8kb的STSTA片段（保留Survivin啟動(dòng)子、除G5E4T外的TSTA系統(tǒng)和部分載體序列）和約3.3kb的G5E4T－BikDD－WPRE片段（保留 G5E4T、BikDD、熒光素酶編碼基因、WPRE和poly A序列）。用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建成S－VISA－BikDD載體，分別利用G5E4T和Bik引物進(jìn)行PCR篩選及雙酶切（KpnI/SalI）鑒定。

1.2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ramos、Raji、U937和chang liver細(xì)胞與S－VISA/CMV－BikDD/S－VISA－BikDD/pGL3－basic 質(zhì) 粒 分別溶于無(wú)血清RPMI 1640的電穿孔介質(zhì)中，將細(xì)胞懸液移入石英電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)條件：電壓270V，穿孔時(shí)間14.4ms。電轉(zhuǎn)完成后立即將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，48h后終止培養(yǎng)，收獲細(xì)胞。

1.2.6 Western blot檢測(cè)Bik蛋白表達(dá) 分別收集質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染48h后各組細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞抽提蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性后取60μg總蛋白進(jìn)行10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，蛋白通過(guò)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。一抗（鼠抗人Bik單克隆抗體）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，二抗為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠抗體，室溫孵育1h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光試劑ECL（enhanced chemiluminescence）發(fā)光、顯影和定影。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Raji細(xì)胞凋亡 離心、收集轉(zhuǎn)染S－VISA、CMV－BikDD、S－VISA－BikDD質(zhì)粒48h后的Raji細(xì)胞1×106個(gè)/mL，加入PI室溫避光孵育40min，流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 MTT 實(shí)驗(yàn)取轉(zhuǎn)染S－VISA、CMVBikDD、S－VISA－BikDD質(zhì)粒48h后的細(xì)胞，各孔加入 MTT溶液（5mg/mL）20μL，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液，再加入DMSO 150μL/孔，充分振蕩15min溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（OD）值。以轉(zhuǎn)染pGL3－basic的細(xì)胞為對(duì)照組，抑制率＝（對(duì)照組OD值－質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較。本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用One－Way ANOVA檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較采用S－N－Kq檢驗(yàn)法，相關(guān)分析采用直相關(guān)計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pGL3－BikDD的鑒定

以人類腸基因組RNA為模版，PCR擴(kuò)增Bik基因后連入pGL3－basic載體，構(gòu)建成pGL3－Bik載體。利用定點(diǎn)突變技術(shù)將第33位蘇氨酸殘基編碼基因ACT突變?yōu)镚AC，第35位絲氨酸殘基編碼基因TCT突變?yōu)镚AT，即分別將第97～99及103～105位的堿基突變，PCR酶切鑒定結(jié)果（圖1）。測(cè)序結(jié)果與GeneBank上公布的Bik基因序列一致。

圖1 pGL3－BikDD載體酶切鑒定圖

2.2 CMV－BikDD載體的鑒定

重組載體CMV－BikDD的酶切鑒定。BgiⅡ和HindⅢ雙酶切pGL3－BikDD和pGL3－CMV載體，回收BikDD片段和pGL3－CMV載體片段。用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建成 pGL3－CMV－BikDD 載體。雙酶切鑒定結(jié)果（圖2）。

圖2 CMV－BikDD載體酶切鑒定

2.3 S－VISA－BikDD載體的構(gòu)建

重組載體S－VISA－BikDD的構(gòu)建及酶切鑒定。BgiⅡ和 HindⅢ雙酶切pGL3－BikDD和 G5E4TWPRE載體，回收的BikDD片段和G5E4T－WPRE片段用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建成G5E4TBikDD－WPRE過(guò)渡載體。再經(jīng)KpnI和SalI雙酶切S－TSTA和G5E4T－BikDD－WPRE載體后，回收到約4.8kb的 S－TSTA片段和約3.3kb 的G5E4T－BikDD－WPRE片段，進(jìn)一步用T4DNA連接酶連接，PCR雙酶切鑒定結(jié)果（圖3）。

圖3 S－VISA－BikDD載體酶切鑒定

2.4 轉(zhuǎn)染前后淋巴瘤細(xì)胞和肝細(xì)胞的Bik表達(dá)水平

收集S－VISA－BikDD轉(zhuǎn)染前、后的淋巴瘤細(xì)胞Raji、Ramos和 U937和肝細(xì)胞chang liver作Western blot檢測(cè)。轉(zhuǎn)染前的淋巴瘤細(xì)胞中Bik蛋白表達(dá)均低于chang liver細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的淋巴瘤細(xì)胞中Bik蛋白表達(dá)均較前有上升，但仍低于chang liver細(xì)胞的Bik蛋白表達(dá)水平，而chang liver細(xì)胞在BikDD處理前后無(wú)明顯變化（圖4）。

圖4 S－VISA－BikDD載體轉(zhuǎn)染前后淋巴瘤細(xì)胞和肝細(xì)胞的Bik表達(dá)水平

2.5 S－VISA－BikDD對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染S－VISA－BikDD對(duì)于淋巴瘤細(xì)胞Raji、Ramos和U937有明顯生長(zhǎng)抑制作用，并且均強(qiáng)于CMV－BikDD，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)于chang liver細(xì)胞無(wú)顯著生長(zhǎng)抑制作用，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染SVISA對(duì)于淋巴瘤細(xì)胞Raji、Ramos、U937、hut78和chang liver細(xì)胞均無(wú)生長(zhǎng)抑制作用，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染CMV－BikDD對(duì)于淋巴瘤細(xì)胞Raji、Ramos、U937和chang liver細(xì)胞均有顯著生長(zhǎng)抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

圖5 S－VISA－BikDD與CMV－BikDD轉(zhuǎn)染對(duì)淋巴瘤和肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用比較

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

為探討上述載體轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞凋亡的影響，筆者用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了Raji、Ramos、U937和chang liver 4種細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示：對(duì)照組（2.67±0.31）%；S－VISA 組（7.34±0.76）%，SVISA－BikDD組（28.93±4.25）%，CMV－BikDD組（17.62±2.17）%。結(jié)果表明，S－VISA－BikDD 及CMV－BikDD轉(zhuǎn)染對(duì)淋巴瘤Raji細(xì)胞有明顯凋亡誘導(dǎo)作用，且S－VISA－BikDD對(duì)于Raji細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用較CMV－BikDD明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

Bcl－2家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Bik是其中一種重要的促凋亡蛋白。最新研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著死亡信號(hào)的刺激，Bik磷酸化后，可以與抗凋亡蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使其他促凋亡蛋白直接激活Bax。Bax移位到線粒體并形成同源二聚體通道，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，導(dǎo)致caspase的激活和細(xì)胞凋亡［10］。

Sturm等［11］研究顯示，Bik高表達(dá)于正常腎上皮中，而腎細(xì)胞癌中由于染色體22q13.2中的Bik位點(diǎn)雜合性丟失及表觀遺傳學(xué)啟動(dòng)子沉寂而導(dǎo)致Bik基因表達(dá)失活。Van Keimpema等［12］闡明彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的生存率低與Bik蛋白編碼基因表達(dá)減低相關(guān)。Brosseau等［13］發(fā)現(xiàn)，治療套細(xì)胞淋巴瘤的一種新的有效藥物來(lái)那度胺與1α，25－二羥維生素D3聯(lián)合應(yīng)用，明顯促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞死亡，其作用與Bik表達(dá)上調(diào)相關(guān)，這種表達(dá)上調(diào)與Bik mRNA水平增長(zhǎng)有關(guān)。Bik基因沉寂阻止了這兩種藥物誘導(dǎo)的凋亡，證實(shí)Bik直接參與細(xì)胞死亡。Hong等［14］在 MCF－7和 MDA－MB231人類乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)植物血凝素與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)檢測(cè)到包括Bik蛋白在內(nèi)的促凋亡蛋白表達(dá)上升。Guo等［15］通過(guò)對(duì)濾泡性淋巴瘤患者基因表達(dá)譜的分析，鑒定出包括Bik在內(nèi)的幾種基因在zeste同源物2（EZH2）啟動(dòng)子突變型病例中其mRNA表達(dá)水平降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淋巴瘤細(xì)胞Raji、Ramos及U937的Bik蛋白表達(dá)水平與作為正常對(duì)照的肝細(xì)胞chang liver相比顯著降低，與前述研究結(jié)果一致。

Xie等［16］構(gòu)建了含 BikDD、hTERT 啟動(dòng)子及VISA系統(tǒng)的腫瘤靶向治療基因T－VISA－BikDD，將其導(dǎo)入多種乳腺癌鼠模型中，發(fā)現(xiàn)該治療基因可引起有效的抗腫瘤效應(yīng)，延長(zhǎng)病鼠生存期。近來(lái)，Xie等［17］在前列腺癌鼠模型中進(jìn)行腫瘤靶向性基因治療研究，將T－VISA－BikDD載體進(jìn)一步聯(lián)合雄激素反應(yīng)區(qū)域（ARR）構(gòu)建成AT－VISA－BikDD載體，導(dǎo)入前列腺癌鼠模型，抑制了前列腺癌生長(zhǎng)并延長(zhǎng)病鼠存活期，且對(duì)機(jī)體無(wú)明顯毒副作用。以上實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，T－VISA作為啟動(dòng)子的毒性作用明顯低于CMV 啟動(dòng)子。本實(shí)驗(yàn)將 S－VISA－BikDD、CMVBikDD和對(duì)照S－VISA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人淋巴瘤細(xì)胞Raji、Ramos、U937和肝細(xì)胞chang liver后，筆者發(fā)現(xiàn)S－VISA－BikDD及CMV－BikDD對(duì)于上述3種淋巴瘤細(xì)胞均有明顯生長(zhǎng)抑制作用，S－VISA－BikDD的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于 CMV－BikDD（P＜0.05）；SVISA－BikDD轉(zhuǎn)染對(duì)于chang liver細(xì)胞無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制作用（P＞0.05），但 CMV－BikDD 對(duì) chang liver細(xì)胞表現(xiàn)出抑制作用（P＜0.05）。本研究結(jié)果表明，S－VISA載體選擇性地驅(qū)動(dòng)BikDD在淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了BikDD在淋巴瘤細(xì)胞中的高效、特異性表達(dá)，避免了對(duì)正常細(xì)胞的急性毒性作用。凋亡檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了S－VISA－BikDD特異性促淋巴瘤細(xì)胞凋亡的作用，其作用較CMVBikDD明顯增強(qiáng)。因此，對(duì)于淋巴瘤的基因治療而言，S－VISA－BikDD可能比 CMV－BikDD更為有力，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性低，與以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，S－VISA－BikDD載體的成功構(gòu)建及其促凋亡作用研究，為淋巴瘤基因治療找到了新的思路及靶標(biāo)，為進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)的可行性及安全性提供了可靠依據(jù)，具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。

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