退變髓核細胞拉伸實驗的形態(tài)學研究*

任國梁 牛建鵬 任龍韜 王祺

脊柱退變始于椎間盤，30歲后即可發(fā)生，生物力學的改變及外力的作用使椎間盤退變進一步加劇，引起纖維環(huán)撕裂最終導致椎間盤膨出或突出而出現(xiàn)一系列臨床癥狀[1]。腰椎間盤突出癥是一種常見多發(fā)病，以腰痛、下肢放射性疼痛為特點，可嚴重影響患者的工作和生活，大多數(shù)患者可以通過非手術(shù)治療取得滿意的療效[2]。牽引治療腰椎間盤突出癥有明顯效果，是非手術(shù)治療腰椎間盤突出癥的主要方法之一。椎間盤體內(nèi)環(huán)境復雜，互相影響因素多，研究其退變機制比較困難。但將椎間盤細胞或組織分離出來并置于人工環(huán)境中培養(yǎng)制備模型，能夠排除干擾因素而針對單因素研究，容易控制人為干預(yù)，是研究椎間盤退變機制及其治療的好方法[3]。本研究通過對人退變髓核細胞的拉伸來模擬臨床中牽引治療腰椎間盤突出癥，比較拉伸前后退變髓核細胞形態(tài)學及細胞數(shù)量的變化，結(jié)合臨床牽引對椎間隙拉伸幅度的改變，為臨床上腰椎間盤突出癥牽引治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 退變髓核細胞的拉伸實驗

1.1.1 髓核細胞的培養(yǎng) 選擇2012年9-12月在本科手術(shù)治療的腰椎間盤突出癥志愿者60例，男30例，女30例，年齡55～67歲。取術(shù)中廢棄髓核組織（倫理委員會審核同意）經(jīng)病理檢查證實為退變椎間盤組織，于無菌條件下提取髓核細胞并原代培養(yǎng)[4-5]，培養(yǎng)7～15 d，待細胞貼滿瓶底且呈類圓形或梭形時，經(jīng)處理后吹勻細胞并接種到BioFlex細胞培養(yǎng)板，于恒溫37 ℃、恒濕的CO2孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，高倍鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.1.2 Flexcercell 4000柔性基底拉伸系統(tǒng)的組成及原理 采用美國Flexercell公司生產(chǎn)的細胞柔性基底加載裝置（F4000 tension，太原理工大學生物力學實驗室），本裝置由計算機控制器、負壓輸出控制器、負壓真空泵、基底板、密封墊、載入平臺及BioFlex培養(yǎng)板組成，用來對體外培養(yǎng)的組織或細胞施加拉伸。該系統(tǒng)是通過一個真空泵抽吸特制的柔性細胞培養(yǎng)膜，形成負壓而使培養(yǎng)膜產(chǎn)生拉伸應(yīng)力，使黏附生長的細胞受到拉伸張力的作用[6]。細胞所受力的大小與培養(yǎng)膜的牽拉幅度呈正比，整個加載裝置放置于恒溫37 ℃、恒濕的CO2孵箱內(nèi)，加載程序由F4000軟件自動控制。

1.1.3 加載程式 程式：膠原I型基底膜；空白對照組（A組）、5%拉伸幅度組（B組）、10%拉伸幅度組（C組）及15%拉伸幅度組（D組）；加載時間24 h，頻率0.1 Hz，波形為正弦波。

1.1.4 退變髓核細胞的接種、拉伸 將培養(yǎng)瓶中髓核細胞以1×104個/mL的密度接種到BioFlex培養(yǎng)板上，孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，細胞貼壁、融合生長后更換為10%胎牛血清的DMEM/F12高糖培養(yǎng)液，依預(yù)定程式進行加載，加載完成后卸載，高倍鏡下拍照。

1.2 臨床腰椎間盤突出癥的牽引實驗 對經(jīng)MRI證實的L3/4、L4/5及L5/S1椎間盤突出癥患者（男性志愿者，55歲，體重80 kg），用多功能牽引床分別以體重的20%、30%、35%牽引力（當牽引力達體重的40%時，志愿者無法耐受）各牽引6次，1次/d。檢查腰椎間盤突出癥的理想手段為CT和MRI，但隨著X線設(shè)備的發(fā)展，CR的出現(xiàn)，診斷精確度越來越高，因此X線檢查仍具有重要的臨床價值及意義[7]。拍攝牽引前、牽引30 min時床旁腰椎側(cè)位X線片（移動式DR X線機），測量各椎間隙高度。以牽引前L3/4、L4/5及L5/S1椎間隙作標準，比較牽引30 min時各椎間隙高度的變化（%），即得出L3/4、L4/5及L5/S1椎間隙牽引增加的幅度。牽引實驗分為三組，即20%體重牽引組、30%體重牽引組和35%體重牽引組，比較三個牽引組經(jīng)過牽引30 min時各椎間隙增高程度的差異。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用PEMS 3.1統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x-±s）表示，三組比較采用方差分析，三組間兩兩比較采用方差分析，計數(shù)資料比較采用x2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 牽引實驗

2.1.1 牽引前后各組腰3/4的椎間隙高度的比較 由表1可知，牽引前三組腰3/4椎間隙高度無統(tǒng)計學差異（P>0.05），牽引30 min時三組椎間隙高度和牽引前后椎間隙增加幅度均存在統(tǒng)計學差異（P<0.05），表現(xiàn)為20%體重組<30%體重組<35%體重組，且各組牽引前后的椎間隙高度存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

表1 牽引前后各組腰3/4的椎間隙高度的比較（±s）

表1 牽引前后各組腰3/4的椎間隙高度的比較（±s）

組別 牽引前（mm） 牽引30 min（mm） 椎間隙增加幅度（%） F值 P值20%體重組（n=20） 12.93±0.36 13.57±0.38 5.00±0.04 -80.554 0.000 30%體重組（n=20） 12.93±0.32 14.17±0.38 9.63±0.65 -31.743 0.000 35%體重組（n=20） 12.98±0.35 14.97±0.47 15.26±0.78 -34.159 0.000 F值 0.055 17.278 462.603 - -P值 0.946 0.000 0.000 - -

2.1.2 牽引前后各組腰4/5的椎間隙高度的比較 由表2可知，牽引前三組腰4/5椎間隙高度無統(tǒng)計學差異（P>0.05），牽引30 min時三組椎間隙高度和牽引前后椎間隙增加幅度均存在統(tǒng)計學差異（P<0.05），表現(xiàn)為20%體重組<30%體重組<35%體重組，且各組牽引前后的椎間隙高度存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

2.1.3 牽引前后各組腰5/骶1的椎間隙高度的比較 由表3可知，牽引前三組腰5/骶1椎間隙高度無統(tǒng)計學差異（P>0.05），牽引30 min時三組椎間隙高度和牽引前后椎間隙增加幅度均存在統(tǒng)計學差異（P<0.05），表現(xiàn)為20%體重組<30%體重組<35%體重組，且各組牽引前后的椎間隙高度存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

表2 牽引前后各組腰4/5的椎間隙高度的比較（±s）

表2 牽引前后各組腰4/5的椎間隙高度的比較（±s）

組別 牽引前（mm） 牽引30 min（mm） 椎間隙增加幅度（%） F值 P值20%體重組（n=20） 14.86±0.62 15.62±0.65 5.09±0.17 -48.397 0.000 30%體重組（n=20） 14.85±0.21 16.33±0.23 10.00±0.20 -109.179 0.000 35%體重組（n=20） 14.68±0.45 16.87±0.53 14.95±0.26 -58.839 0.000 F值 0.307 9.285 3166.202 - -P值 0.740 0.002 0.000 - -

表3 牽引前后各組腰5/骶1的椎間隙高度的比較（±s）

表3 牽引前后各組腰5/骶1的椎間隙高度的比較（±s）

組別 牽引前（mm） 牽引30 min（mm） 椎間隙增加幅度（%） F值 P值20%體重組（n=20） 8.39±0.43 8.82±0.44 5.23±0.25 -40.679 0.000 30%體重組（n=20） 8.37±0.24 9.23±0.29 10.27±0.37 -41.313 0.000 35%體重組（n=20） 8.37±0.43 9.63±0.50 15.00±0.46 -36.932 0.000 F值 0.003 5.469 1060.092 - -P值 0.997 0.016 0.000 - -

2.2 細胞實驗

2.2.1 退變椎間盤髓核細胞拉伸前后比較 圖1為拉伸24 h后未經(jīng)染色的退變髓核細胞：A為對照組；B為5%拉伸幅度；C為10%拉伸幅度；D為15%拉伸幅度。對比退變髓核細胞拉伸前后細胞形態(tài)，A組呈類圓形、梭形及星形，且生長滯緩、細胞折光性差，有明顯老化現(xiàn)象。與A組相比，B組髓核細胞形態(tài)多呈類圓形及梭形，星形及不規(guī)則形；C組髓核細胞形態(tài)則以類圓形為主，突起沿著細胞長軸的兩端且細胞突起短而粗，細胞折光性好；D組髓核細胞形態(tài)多呈星形及不規(guī)則形，細胞體積增大，核變大，細胞突起呈樹枝狀向四周伸出，部分突起未端呈喇叭狀膨大，且有次級突起，細胞折光性差，接近凋亡狀態(tài)。

圖1 退變椎間盤髓核細胞拉伸前后（×40）

2.2.2 不同組別細胞生長個數(shù)的比較 由表4可知，不同組的細胞個數(shù)存在統(tǒng)計學差異（F=201.144，P=0.000），表現(xiàn)為10%拉伸幅度組>5%拉伸幅度組>對照組>15%拉伸幅度組。

表4 不同組別細胞生長個數(shù)的比較（±s）

表4 不同組別細胞生長個數(shù)的比較（±s）

組別 細胞個數(shù)（個）對照組（A）（n=15） 59.33±9.69 5%拉伸幅度組（B）（n=15） 109.17±14.08 10%拉伸幅度組（C）（n=15） 177.33±11.94 15%拉伸幅度組（D）（n=15） 34.33±6.31

3 討論

椎間盤退行性變是引起下腰痛的主要原因[8]。椎間盤退變主要表現(xiàn)在髓核細胞和細胞外基質(zhì)成分的改變。椎間盤退變源于椎間盤細胞的數(shù)量減少和功能異常，繼而椎間盤分散脊柱壓縮力、維持椎間隙高度的生物力學功能喪失，最終導致椎管狹窄、神經(jīng)根受壓并產(chǎn)生腰腿痛[9]。關(guān)于腰椎間盤突出癥的治療，分為非手術(shù)療法和手術(shù)療法，只要嚴格掌握適應(yīng)證均有良好療效。非手術(shù)療法是本病的基礎(chǔ)治療，可使85%～90%的患者治愈或緩解，據(jù)10年以上隨訪功能評價，手術(shù)療法組與非手術(shù)療法組無顯著差異性，循證醫(yī)學尚不足以支持何種治療方法更好，無優(yōu)劣之分[10]。

髓核細胞的老化率與椎間盤的退變等級成正相關(guān)[11]。正常髓核細胞形態(tài)學以類圓形及短梭形為主，細胞突起短而粗、沿著細胞長軸的兩端突起，且只有初級突起，呈樹枝狀向四周發(fā)出。髓核細胞從分類上其實是一種類軟骨細胞[12]，若持續(xù)傳代則出現(xiàn)纖維樣變，與原代細胞形態(tài)差別較大。有研究觀察到髓核細胞經(jīng)體外培養(yǎng)并多次傳代后，髓核細胞將經(jīng)歷顯著的形態(tài)學變化[13]。本實驗用原代退變髓核細胞進行生物力學拉伸以避免多次傳代造成的細胞生物學性狀改變。通過對四組對照的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)B組細胞形態(tài)向正常髓核細胞發(fā)展，C組細胞形態(tài)接近于正常髓核細胞，D組細胞形態(tài)接近凋亡。通過表4可得各組細胞數(shù)量：10%拉伸幅度組>5%拉伸幅度組>對照組>15%拉伸幅度組，細胞拉伸后形態(tài)學及細胞數(shù)量的改變說明較小的拉伸幅度不足以促進退變髓核細胞的修復，而過大的拉伸幅度不利于退變髓核細胞的修復，故10%拉伸幅度最有利于退變髓核細胞的生長。

治療椎間盤疾病一種可行的方法是在其早期進行動態(tài)牽引，這可以增加椎間盤的高度、改善椎間盤代謝，使椎間盤水分和營養(yǎng)物質(zhì)增加，動態(tài)牽引裝置可能在椎間盤疾病的治療中扮演越來越重要的角色[14]。牽引的作用機制為：（1）使腰背部肌肉痙攣緩解，糾正脊柱側(cè)凸；（2）使椎間隙增寬，突出物部分回納，減輕對神經(jīng)根的機械刺激；（3）上下關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)間隙增寬，使關(guān)節(jié)滑膜的擠壓減輕，疼痛緩解或消失；（4）使粘連的神經(jīng)根松解，改善神經(jīng)根血運并促使周圍的炎性介質(zhì)減少，從而改善神經(jīng)的感覺和運動功能[15-20]。根據(jù)臨床牽引實驗結(jié)果，牽引30 min時三組椎間隙高度和牽引前后椎間隙增加幅度均存在統(tǒng)計學差異，且20%體重組牽引30 min時各椎間隙增加幅度為5%左右、30%體重組牽引30 min時各椎間隙增加幅度為10左右%、35%體重組牽引30 min時各椎間隙增加幅度為15%左右。

本實驗對退變椎間盤髓核細胞進行力學拉伸，以力求模擬牽引治療腰椎間盤突出癥，當牽引力為體重的30%時，椎間隙增高幅度為10%左右，在髓核細胞的拉伸實驗中10%拉伸幅度最有利于退變髓核細胞的生長，故可以間接推斷出當牽引力為體重的30%時，有利于退變髓核細胞的修復，說明30%體重牽引力適合于腰椎間盤突出癥患者的牽引治療。

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