小鼠免疫性接觸性蕁麻疹動(dòng)物模型的構(gòu)建

李潤(rùn)祥 馮承恩 梁碧華 田歆 朱慧蘭

小鼠免疫性接觸性蕁麻疹動(dòng)物模型的構(gòu)建

李潤(rùn)祥 馮承恩 梁碧華 田歆 朱慧蘭

目的 建立小鼠免疫性接觸性蕁麻疹動(dòng)物模型。方法 將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分5組：抗二硝基苯酚IgE單克隆抗體（抗DNP IgE）+二硝基氟苯（DNFB）組和抗DNP IgE+偏苯三酸酐（TMA）組小鼠尾靜脈注射抗DNP IgE，24 h后分別在小鼠耳部涂DNFB和TMA；DNFB組、TMA組、生理氯化鈉液（NS）組小鼠尾靜脈注射N(xiāo)S，24 h后分別在小鼠雙耳涂DNFB、TMA、NS，觀察小鼠在14 d內(nèi)的風(fēng)團(tuán)、瘙癢情況、肥大細(xì)胞脫顆粒數(shù)、脾臟指數(shù)和皮膚病理。結(jié)果 抗DNP IgE+DNFB組全部（12/12）和抗DNP IgE+TMA組部分小鼠（8/12）產(chǎn)生風(fēng)團(tuán)；抗DNP IgE+DNFB組及抗DNP IgE+TMA組小鼠的搔抓次數(shù)［30 min時(shí)分別為（31.58±3.58）次/h，（22.17±3.81）次/h］、肥大細(xì)胞脫顆粒率［（70.21±26.01）%，（54.25±39.57）%］及脾臟指數(shù)（7.54±1.56，7.87±1.18）與 NS組［（2.00± 0.85）次/h，（14.45± 6.79）%，5.37± 1.16］相比均顯著增加（F值分別為 437.86、14.41、4.29，均P＜0.01）；DNFB組、TMA組及NS組均無(wú)風(fēng)團(tuán)產(chǎn)生。結(jié)論 通過(guò)抗DNP IgE誘導(dǎo)及DNFB激發(fā)后可快速、較穩(wěn)定地建立小鼠免疫性接觸性蕁麻疹動(dòng)物模型。

蕁麻疹；疾病模型，動(dòng)物；小鼠；皮炎，變應(yīng)性接觸性；二硝基苯類(lèi)；二硝基氟苯

蕁麻疹發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前治療仍棘手，實(shí)驗(yàn)研究與缺乏理想的動(dòng)物模型有關(guān)，因此建立蕁麻疹動(dòng)物模型對(duì)蕁麻疹的研究具有重要意義。在蕁麻疹的模型研究中，Lahti等［1］以二甲亞砜或桂皮酸涂抹豚鼠耳廓兩面，構(gòu)建了非免疫性接觸性蕁麻疹。Lauerma 等［2］用偏苯三酸酐（trimellitic anhydride，TMA）誘發(fā)BALB/c小鼠接觸性蕁麻疹時(shí)發(fā)現(xiàn)，有免疫性接觸性蕁麻疹發(fā)病機(jī)制的存在。其他蕁麻疹動(dòng)物模型研究主要采用注射組胺或建立被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)或建立Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)模型，但這些方法建立的動(dòng)物模型只能模擬蕁麻疹的部分臨床表現(xiàn)。我們?cè)谘芯科つw三相過(guò)敏反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)昆明小鼠背部出現(xiàn)風(fēng)團(tuán)樣的皮損，考慮此反應(yīng)可能會(huì)引起蕁麻疹，遂采用抗二硝基苯酚（抗DNP）IgE單克隆抗體致敏敏感性更高的BALB/c小鼠，并用2,4二硝基氟苯（DNFB）激發(fā)以構(gòu)建免疫性接觸性蕁麻疹模型?？紤]到DNFB和TMA均是小分子致敏物質(zhì)，可誘發(fā)哮喘、接觸性皮炎等過(guò)敏反應(yīng)，有時(shí)會(huì)把兩者放在一起研究［3］，且 TMA 也可能會(huì)誘發(fā)蕁麻疹［2］，故將其一起研究。

資料與方法

一、資料

60 只 BALB/c小鼠，雌雄各半，（20± 2）g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，動(dòng)物合格證號(hào)44002100001315?？笵NP IgE單克隆抗體、TMA（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；DNFB（成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司）。

二、方法

1.分組及造模：將小鼠隨機(jī)分成5組，每組各12只，每組預(yù)先背部去毛2 cm×3 cm，參考三相反應(yīng)的造模方法［4］?？?DNP IgE+DNFB 組、抗 DNP IgE+TMA組小鼠尾靜脈各注射1∶5 000抗DNP IgE單克隆抗體0.5 ml，DNFB組、TMA組、生理氯化鈉液（NS）組小鼠尾靜脈各注射N(xiāo)S 0.5 ml。24 h后，分別在抗DNP IgE+DNFB組、DNFB組小鼠雙耳各涂0.15%DNFB 50 μl進(jìn)行激發(fā)，抗DNP IgE+TMA組、TMA 組小鼠耳部各涂 500 g/L TMA 50 μl，NS 組涂NS，隨后放入小鼠透明觀察籠。激發(fā)14 d后處死小鼠，實(shí)驗(yàn)期間小鼠正常飲食。

2.觀察指標(biāo)：①一般情況：每天觀察記錄小鼠一般情況；②風(fēng)團(tuán)：尾靜脈注射伊文思藍(lán)后采用自動(dòng)定時(shí)拍照，每30分鐘拍攝1次，記錄小鼠背部暴露部位風(fēng)團(tuán)數(shù)量、次數(shù)、大小、消退時(shí)間；③小鼠搔抓行為：于激發(fā)前和激發(fā)后0.5、12 h及以后14 d每天定時(shí)持續(xù)拍攝小鼠活動(dòng)10 min，錄像回放，統(tǒng)計(jì)搔抓次數(shù)［5］；④脾臟指數(shù)：剝離脾臟，稱(chēng)重，計(jì)算方法為：脾臟指數(shù)（mg/g）= 脾臟重量（mg）/小鼠體重（g）［6］；⑤肥大細(xì)胞脫顆粒率：小鼠處死后，腹腔注射臺(tái)氏液（含肝素）兩次，每次間隔2～3 min，輕揉腹壁10 min，將腹腔內(nèi)容物推向一側(cè)，吸出腹腔液，置于涂有硅油的試管中。671×g離心，棄上清液，將沉淀物重新混在2 ml臺(tái)氏液，配制成106肥大細(xì)胞懸液，各管加臺(tái)氏液至0.9 ml，37℃水浴5 min，輕搖勻，再水浴15 min后冰浴。吸取試管內(nèi)懸液2滴，滴于載玻片上與中性紅染料混勻，在×100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)肥大細(xì)胞，計(jì)算2次取平均值。肥大細(xì)胞脫顆粒率（%）=脫顆粒肥大細(xì)胞/肥大細(xì)胞總數(shù)×100%；⑥組織病理：處死小鼠后，切下皮損組織用4%甲醛液固定，石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察組織病理改變。參考蕁麻疹的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以反復(fù)發(fā)作的風(fēng)團(tuán)、瘙癢為造模成功的參考標(biāo)準(zhǔn)。

3.統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料的數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD法，不齊時(shí)用Dunnetts T3，統(tǒng)計(jì)分析風(fēng)團(tuán)和搔抓行為時(shí)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

與DNFB、TMA、NS組相比，抗 DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組小鼠在激發(fā)24 h后精神狀態(tài)較差，活動(dòng)減少，毛色較為零亂，食量明顯減少，排泄物明顯減少，睡眠時(shí)間明顯減少。與NS組比較，抗DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組小鼠在第6天到第8天體重增長(zhǎng)明顯減緩甚至下降，抗DNP IgE+DNFB組、抗DNP IgE+TMA組和NS組第7天體重增長(zhǎng)率分別為（4.6±3.6）%、（5.8 ± 3.6）%、（12.7 ± 7.0）%，DNP IgE+DNFB 組、抗DNP IgE+TMA組與NS組相比，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為 2.9、3.1，P分別為 0.002、0.006）。

二、風(fēng)團(tuán)情況

激發(fā)24 h后，抗DNP IgE+DNFB組中全部小鼠（12/12）和抗DNP IgE+TMA組中8只小鼠（8/12），背部脫毛區(qū)相繼出現(xiàn)數(shù)量不等的風(fēng)團(tuán)，尾靜脈注射伊文思藍(lán)后小鼠背部可以見(jiàn)到明顯的藍(lán)色斑，稍隆起?？笵NP IgE+DNFB組風(fēng)團(tuán)直徑約0.1～0.3 cm大小，抗DNP IgE+TMA組風(fēng)團(tuán)直徑約為0.1 cm大小，風(fēng)團(tuán)3～4 h消退，但反復(fù)發(fā)作，抗DNP IgE+DNFB組風(fēng)團(tuán)出現(xiàn)次數(shù)大于抗DNP IgE+TMA組（F＝7.79，P＝0.011）。而 DNFB、TMA、NS組均未見(jiàn)風(fēng)團(tuán)（圖1）?？笵NP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組小鼠的風(fēng)團(tuán)均在第3天達(dá)到高峰，分別達(dá)9.8±1.1次和5.8±4.4次，后緩慢減少（圖2）。

三、搔抓行為

與NS組比較，各組小鼠的在造模后的搔抓次數(shù)均顯著升高（F值為437.86，均P＜0.01），其中抗DNP IgE+DNFB組升高最明顯，抗DNP IgE+TMA組次之，DNFB組與TMA組組間無(wú)明顯差別。各組小鼠的搔抓次數(shù)均在造模后30 min出現(xiàn)高峰，在第7天，抗DNP IgE+DNFB組小鼠的搔抓次數(shù)出現(xiàn)另一個(gè)峰值（圖3）。

圖1 小鼠背部風(fēng)團(tuán)情況 1A：抗二硝基苯酚（抗DNP）IgE+二硝基氟苯（DNFB）組（左）和抗DNP IgE+偏苯三酸酐（TMA）小鼠（右）背部出現(xiàn)藍(lán)斑，抗DNP IgE+DNFB組藍(lán)斑量較多（箭頭）；1B：生理氯化鈉（NS）組（左）背部未出現(xiàn)藍(lán)斑，抗DNP IgE+DNFB組（右）小鼠背部出現(xiàn)藍(lán)斑；1C，1D：DNFB組和TMA組背部未出現(xiàn)藍(lán)斑

圖2 抗二硝基苯酚（抗DNP）IgE+二硝基氟苯（DNFB）組和抗DNP IgE+偏苯三酸酐（TMA）組造模后風(fēng)團(tuán)發(fā)生次數(shù)，均在第3天達(dá)高峰，隨后逐漸下降。DNFB組、TMA組及生理氯化鈉（NS）組均無(wú)風(fēng)團(tuán)產(chǎn)生，重合為一條線(xiàn)（下方紅線(xiàn)）

四、脾臟指數(shù)

與NS組比較，抗DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 實(shí)驗(yàn)各組小鼠的脾臟指數(shù)和肥大細(xì)胞脫顆粒情況

五、肥大細(xì)胞脫顆粒測(cè)定

抗DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組的肥大細(xì)胞脫顆粒率均明顯高于NS組（均P＜0.01），抗DNP IgE+DNFB 組也顯著高于DNFB組（P＜0.01），抗DNP IgE+TMA組顯著高于TMA組（P＜0.01），抗DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DNFB組、TMA組及 NS組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

六、組織病理

抗DNP IgE+DNFB組小鼠皮膚組織表皮正常，真皮水腫、膠原束距離增寬，血管周?chē)∈柩装Y細(xì)胞浸潤(rùn)；抗DNP IgE+TMA組部分真皮水腫；DNFB組、TMA組及NS組小鼠表皮正常，膠原纖維排列整齊，無(wú)卷曲斷裂，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4）。

討 論

圖3 各組造模后搔抓行為的改變。造模后抗二硝基苯酚（抗DNP）IgE+二硝基氟苯（DNFB）組和抗DNP IgE+偏苯三酸酐（TMA）組搔抓行為明顯增加，DNFB組、TMA組早期有所增加，生理氯化鈉（NS）組無(wú)改變

蕁麻疹主要表現(xiàn)為風(fēng)團(tuán)和瘙癢，自發(fā)或誘導(dǎo)，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，仍未完全清楚。接觸性蕁麻疹在誘導(dǎo)部分中占相當(dāng)大部分，主要表現(xiàn)為接觸致敏物后出現(xiàn)皮膚發(fā)紅、風(fēng)團(tuán)、瘙癢。接觸性蕁麻疹還可再分為免疫性和非免疫性。免疫性接觸性蕁麻疹的皮疹可以局限于接觸部位，也可以累及未接觸部位，甚至泛發(fā)全身，并伴有呼吸道、消化道及眼結(jié)膜等系統(tǒng)受累［7］。

DNFB致敏后可產(chǎn)生抗DNP-IgE抗體，注射抗DNP-IgE抗體可引起皮膚肥大細(xì)胞被動(dòng)致敏［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用抗DNP IgE單克隆抗體致敏，再用DNFB激發(fā)，可以使BALB/c小鼠產(chǎn)生風(fēng)團(tuán)、瘙癢等癥狀，符合蕁麻疹臨床特征，病理檢查可見(jiàn)到風(fēng)團(tuán)處的真皮部位出現(xiàn)明顯水腫，真皮膠原束間距離增寬，血管周?chē)∈柩准?xì)胞浸潤(rùn)，符合蕁麻疹的病理特征。致敏后利用TMA激發(fā)也可以誘發(fā)部分的小鼠出現(xiàn)蕁麻疹，而單純單次外用DNFB、TMA則未能誘發(fā)蕁麻疹，僅早期瘙癢增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，抗DNP IgE單克隆抗體能明顯提高BALB/c小鼠對(duì)抗原的敏感性。

另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)風(fēng)團(tuán)的發(fā)生次數(shù)及搔抓次數(shù)與三相過(guò)敏反應(yīng)不一致?？笵NP IgE誘導(dǎo)的皮膚三相過(guò)敏反應(yīng)，在激發(fā)后1 h，24 h和8 d耳廓處分別出現(xiàn)速發(fā)相、遲發(fā)相、超遲發(fā)相反應(yīng)［4］，而本實(shí)驗(yàn)IgE誘導(dǎo)再激發(fā)后背部風(fēng)團(tuán)的發(fā)生次數(shù)及搔抓次數(shù)均未見(jiàn)三相反應(yīng)，僅抗DNP IgE+DNFB組的搔抓次數(shù)在第7天時(shí)可見(jiàn)第二個(gè)峰值，但此峰值比第一峰值明顯下降，而皮膚三相過(guò)敏反應(yīng)中第8天時(shí)耳廓的腫脹度是逐步增多的［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，利用抗DNP IgE單克隆抗體致敏，再用DNFB或TMA激發(fā)，可以在BALB/c小鼠身上復(fù)制出蕁麻疹動(dòng)物模型。

本實(shí)驗(yàn)中抗DNP IgE+DNFB組全部小鼠出現(xiàn)風(fēng)團(tuán)，而抗DNP IgE+TMA組約三分之二小鼠出現(xiàn)風(fēng)團(tuán)，且抗DNP IgE+DNFB組在風(fēng)團(tuán)數(shù)與風(fēng)團(tuán)大小均大于抗DNP IgE+TMA組，說(shuō)明在抗DNP IgE致敏的條件下，DNFB造模的效果優(yōu)于TMA。由于風(fēng)團(tuán)出現(xiàn)在激發(fā)部位以外的地方，且是接觸誘發(fā)，故本次蕁麻疹的動(dòng)物模型考慮為免疫性接觸性蕁麻疹動(dòng)物模型。另外，抗DNP IgE+DNFB組出現(xiàn)Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，與接觸性蕁麻疹相似［9］。風(fēng)團(tuán)是毛細(xì)血管通透性增加的一種表現(xiàn)，毛細(xì)血管通透性增加的檢測(cè)常用伊文思藍(lán)染色后用染料的提取或測(cè)量局部皮下變藍(lán)直徑的方法，盡管它們有良好的復(fù)制率的優(yōu)點(diǎn)，但較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，并且需要特殊的裝置，因此沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用［10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)伊文思藍(lán)染色后再在皮膚表面觀察風(fēng)團(tuán)的方法，雖粗略，但較省時(shí)省力，且符合蕁麻疹風(fēng)團(tuán)的動(dòng)態(tài)變化的觀察。

我們近期發(fā)現(xiàn)蕁麻疹與Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)失衡［11］、凝血系統(tǒng)激活等有關(guān)［12］，但仍認(rèn)為，肥大細(xì)胞和（或）嗜堿性粒細(xì)胞的激活和脫顆粒是蕁麻疹發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)［13］。誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化并脫顆粒的機(jī)制包括免疫性、非免疫性和特發(fā)性。肥大細(xì)胞可被DNFB激活，DNFB和TMA外涂小鼠耳部都可以誘導(dǎo)IgE抗體的產(chǎn)生，引起肥大細(xì)胞脫顆粒［14］。在抗DNP IgE聯(lián)合DNFB誘導(dǎo)三相反應(yīng)時(shí)，肥大細(xì)胞在速發(fā)相中發(fā)揮主要作用，在超遲發(fā)相中和T細(xì)胞發(fā)揮作用［4］。本實(shí)驗(yàn)中，抗 DNP IgE+DNFB 組、抗DNP IgE+TMA組小鼠的肥大細(xì)胞脫顆粒細(xì)胞率明顯高于NS組（P＜0.01），提示此方法能激發(fā)小鼠激活肥大細(xì)胞脫顆粒，使小鼠體內(nèi)出現(xiàn)高敏狀態(tài)，出現(xiàn)免疫內(nèi)環(huán)境的改變。估計(jì)其激活的原因早期與IgE升高有關(guān)，后期則與繼發(fā)的炎癥介質(zhì)有關(guān)，此與蕁麻疹的發(fā)病機(jī)制相符［13］。

在反應(yīng)免疫情況中，還可以通過(guò)脾臟指數(shù)來(lái)反映。脾臟作為機(jī)體最大的外周免疫器官，當(dāng)免疫系統(tǒng)收到刺激時(shí)，脾臟的重量有一定的增生［6］。本實(shí)驗(yàn)中，抗DNP IgE+DNFB組及抗DNP IgE+TMA組的脾臟指數(shù)與NS組比較均明顯增高，但其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？梢?jiàn)造模過(guò)程中，抗DNP IgE+DNFB組及抗DNP IgE+TMA組小鼠的免疫器官受到了一定的影響。此結(jié)果提示脾臟參與了抗DNP IgE+DNFB組及抗DNP IgE+TMA組小鼠的免疫反應(yīng)。

Lauerma 等［2］用 TMA 誘發(fā) BALB/c 小鼠接觸性蕁麻疹時(shí)僅發(fā)現(xiàn)部分為免疫性接觸性蕁麻疹。相比其他注射組胺或建立被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)或Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)模型，本實(shí)驗(yàn)更接近臨床真實(shí)情況，但操作比較復(fù)雜，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

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2014-09-15）

（本文編輯：吳曉初）

Establishment of a mouse model for immunological contact urticaria

Li Runxiang*,Feng Cheng′en,Liang Bihua,Tian Xin,Zhu Huilan.*Guangzhou Institute of Dermatology,Guangzhou 510095,China

Zhu Huilan,Email：zhlhuilan@hotmail.com

ObjectiveTo establish an animal model for immunological contact urticaria in mice.MethodsA total of 60 BALB/c mice were randomly and equally divided into 5 groups：anti-dinitrophenol IgE monoclonal antibody（anti-DNP IgE）+2,4-dinitrofluorobenzene（DNFB）group and anti-DNP IgE+trimellitic anhydride（TMA）group both injected with anti-DNP IgE via tail veins firstly,followed by topical treatment with DNFB and TMA respectively on the ears at 24 hours after the injection,DNFB group,TMA group and normal saline （NS）group all injected with NS via the tail vein firstly,followed by topical treatment with DNFB,TMA and NS on the ears 24 hours after the injection.In the following 14 days,mice were observed daily for the appearance of wheals and for scratching behavior.All the mice were sacrificed at the end of the study followed by determination of the percentage of degranulated mast cells and spleen index as well as observation of pathological changes.ResultsWheals were observed in all the mice （12/12）in the anti-DNP IgE+DNFB group,some mice （8/12）in the anti-DNP IgE+TMA group,but not observed in any mice in the other 3 groups.Compared with the NS group,both the anti-DNP IgE+DNFB group and anti-DNP IgE+TMA group showed a significant increase in the percentage of degranulated mast cells（70.21%±26.01%and 54.25%±39.57%vs.14.45%±6.79%,F=14.41,P=0.000）,spleen index（7.54±1.56 and 7.87±1.18 vs.5.37±1.16,F=4.29,P=0.004）and scratching frequency（（31.58 ± 3.58）/h and（22.17 ± 3.81）/h vs.（2.00 ± 0.85）/h at 30 minutes，F(xiàn)=437.86,P＜ 0.01）.ConclusionA stable mouse model for immunological contact urticaria can be established quickly by sensitization with anti-DNP IgE and challenge with DNFB.

Urticaria;Disease models,animal;Mice;Dermatitis,allergic contact;Dinitrobenzenes;Dinitrochlorobenzene

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.015

廣東省自然科學(xué)基金（S2012020011077）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（A2013543）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（20131A011126）

510095廣州市皮膚病防治所（李潤(rùn)祥、梁碧華、田歆、朱慧蘭）；廣東藥學(xué)院醫(yī)院化工學(xué)院（馮承恩）

朱慧蘭，Email：zhlhuilan@hotmail.com