慢性自發(fā)性蕁麻疹患者血清差異表達(dá)蛋白的篩選及C反應(yīng)蛋白的測(cè)定

徐順明， 曹艷云， 孔 偉， 徐 徉， 蔡海斌

上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院皮膚科,上海 201299

慢性自發(fā)性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria, CSU)是指風(fēng)團(tuán)與血管性水腫自發(fā)性表現(xiàn)超過6周的慢性蕁麻疹[1]。CSU是一種炎癥性疾病，可由免疫、遺傳和環(huán)境因素(包括感染)的相互作用引起[2]，患者血清中存在多種炎癥標(biāo)志物的異常改變。CSU患者血清中C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein, CRP)也存在一定變化，但臨床意義尚不明確。

因此，本研究采用同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量(isobaric tag for relative absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)對(duì)風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間不同的CSU患者血清進(jìn)行差異蛋白鑒定，探討CSU患者血清CRP水平與風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 入選及排除標(biāo)準(zhǔn) 2015年7月至2016年8月我院收治的CSU患者納入研究范圍。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65歲，風(fēng)團(tuán)單個(gè)皮損持續(xù)時(shí)間小于24 h，風(fēng)團(tuán)反復(fù)發(fā)作病程超過6周，且每天或幾乎每天發(fā)作，符合慢性自發(fā)性蕁麻疹診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者就診時(shí)觀察到有風(fēng)團(tuán)存在。排除標(biāo)準(zhǔn)：有過敏性鼻炎、哮喘、特應(yīng)性皮炎等過敏性疾病史和寄生蟲感染史；妊娠及哺乳期婦女；伴血管性水腫、可誘導(dǎo)性蕁麻疹；嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病、吸毒和酗酒者；就診前3 d內(nèi)使用過抗組胺藥物，1個(gè)月內(nèi)使用過皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑、止血或抗凝血藥。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者及健康對(duì)照均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 伯樂公司Protein Miner去除高豐蛋白的試劑盒，iTRAQ同位素定量試劑盒；高pH反相色譜分離：柱子信息為2.1×150 mm X Bridge BEH300(Waters公司，加拿大)；色譜儀器為Waters公司UPLC高效液相色譜；第二維反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS：數(shù)據(jù)采集軟件為Analyst TF (Sciex公司，加拿大)；反相柱信息：ZORBAX 300SB-C18 column(5 μm, 300?, 0.1×150 mm，Microm，美國(guó))；Eksigent 1D plus色譜儀，Triple TOF 5600質(zhì)譜儀(Sciex公司，加拿大)。免疫散射比濁法檢測(cè)儀為普門科技PA-990。

1.3 血清差異蛋白的鑒定

1.3.1 研究對(duì)象及分組 20例CSU患者病程2個(gè)月～48個(gè)月，根據(jù)風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間分為2組：風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間<2 h組(n=10)，其中男性3例，女性7例，年齡20～48歲；風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h組(n=10)，其中男性7例，女性3例，年齡26～61歲。另選10例來自本院的健康體檢者作為健康對(duì)照組，男性5例，女性5例，年齡22～54歲。

1.3.2 標(biāo)本采集及測(cè)定 標(biāo)本采集：2組CSU患者和健康對(duì)照者各抽血5 mL，靜置后4 000 r/min(r=10 cm)，離心5 min，留取上清，分組按序編號(hào)，-80℃保存待測(cè)；血清處理：血清標(biāo)本同批次檢測(cè)，采用ProteoMiner Large-Capacity試劑盒去除高豐度蛋白，洗脫下來的樣品通過Bradford法進(jìn)行定量；利用胰酶對(duì)各組蛋白質(zhì)分別進(jìn)行酶解；利用iTRAQ試劑盒對(duì)各組蛋白進(jìn)行定量標(biāo)記，把標(biāo)記完的樣品混合；混合后的蛋白進(jìn)行2次二維液相色譜質(zhì)譜分析；利用Mascot軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用Paragon算法來執(zhí)行數(shù)據(jù)庫搜索。蛋白質(zhì)檢索數(shù)據(jù)庫為HumanSwissProt。進(jìn)一步篩選差異蛋白進(jìn)行后續(xù)分析。所有實(shí)驗(yàn)包含2次技術(shù)重復(fù)。

1.4 CRP水平的檢測(cè) 在差異蛋白鑒定后，選取63例CSU患者，根據(jù)風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間分為2組：每天風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間<2 h者29例，發(fā)病以來每天風(fēng)團(tuán)發(fā)作持續(xù)時(shí)間12～24 h者34例。另選健康體檢者作為健康對(duì)照組33例。免疫散射比濁法檢測(cè)方法：3組血清標(biāo)本采集如前，血清標(biāo)本同批次檢測(cè)，按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 各組間差異蛋白表達(dá)情況 結(jié)果表明：3組間存在不同數(shù)量的蛋白表達(dá)差異。與健康對(duì)照組相比，風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h組患者的差異表達(dá)蛋白有20個(gè)，其中上調(diào)5個(gè)，下調(diào)15個(gè)；風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間小于2 h組患者的差異蛋白共有31個(gè)，上調(diào)12個(gè)，下調(diào)19個(gè)。風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h組/健康對(duì)照組間及風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間<2 h組/健康對(duì)照組間共同的差異蛋白有14個(gè)，包括上調(diào)蛋白5個(gè)和下調(diào)蛋白9個(gè)。與風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間<2 h組相比，風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h組的差異蛋白18個(gè)，其中上調(diào)4個(gè)，即CRP、serum amyloid P-component (SAP)、monocyte differentiation antigen CD14和putative protein FAM10A5；下調(diào)14個(gè)，包括tropomyosin alpha-4 chain (TM30p1)、keratin-14、Ig gamma-4 chain C region、immunoglobulin kappa variable 1D-33、hemopexin、pleckstrin、cofilin-1、complement factor H-related protein 2、cytokeratin-2e (CK-2e)、cytokeratin-9(CK-9)、actin、cytokeratin-1(CK-1)。3組間CRP均為上調(diào)蛋白，但CRP在風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h組的比值最高；而風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h組和健康對(duì)照組患者CRP比值相近。

2.2 CSU患者與健康對(duì)照組血清CRP水平的比較 結(jié)果表明：風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間<2 h組、風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h組、健康對(duì)照組CRP水平分別為(0.865±2.120)、(3.727±8.416)、(0.447±0.674)mg/L，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.9705，P<0.05)。風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間<2 h組患者CRP水平與風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h組、健康對(duì)照組間均無明顯差異，而后兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

CSU危害生命的風(fēng)險(xiǎn)低，但對(duì)患者生活質(zhì)量的影響很大[3]。臨床上，由于病因和發(fā)病機(jī)制不同，風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間各不相同，部分患者風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間<2 h可自行消退，另有部分患者風(fēng)團(tuán)持續(xù)12～24 h方可消退，伴有明顯瘙癢，給患者帶來了痛苦。目前尚無有效的方法判斷患者風(fēng)團(tuán)的持續(xù)時(shí)間，對(duì)于風(fēng)團(tuán)發(fā)生后的持續(xù)時(shí)間，也無明確的劃分標(biāo)準(zhǔn)，有分為2 h內(nèi)和超過2 h者，以及<24 h和超過24 h者[4]。本研究分為風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間<2 h及風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h進(jìn)行對(duì)比研究。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在CSU研究領(lǐng)域應(yīng)用較少。本研究采用iTRAQ技術(shù)對(duì)風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間不同的CSU患者和健康對(duì)照者之間血清進(jìn)行蛋白表達(dá)研究，結(jié)果表明3組間存在差異表達(dá)蛋白。進(jìn)一步比較組間差異蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14種蛋白為共同差異蛋白。這些蛋白是否與風(fēng)團(tuán)發(fā)作及風(fēng)團(tuán)發(fā)作持續(xù)時(shí)間有關(guān)尚不清楚。目前已經(jīng)確認(rèn)了CSU具有多種潛在的標(biāo)志物[5]。風(fēng)團(tuán)的形成，尤其是持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、不易消退的風(fēng)團(tuán)形成機(jī)制十分復(fù)雜，參與風(fēng)團(tuán)形成的血生物標(biāo)志物更多[6]。本研究鑒定的共同差異蛋白在風(fēng)團(tuán)形成與消退的過程中有無作用及如何發(fā)揮作用有待進(jìn)一步的研究探討。

CRP是經(jīng)典補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的強(qiáng)活化劑，可在某些條件下開始或加劇炎性病變[7]。CSU患者血清CRP是否增高一直存有爭(zhēng)議[8-12]。本研究結(jié)果表明，與健康對(duì)照相比，CSU患者血清中的CRP均為上調(diào)蛋白，說明CRP表達(dá)與CSU風(fēng)團(tuán)發(fā)作有關(guān)。CRP在風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間12～24 h組患者中表達(dá)最明顯，提示CRP表達(dá)與風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間有關(guān)，風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，血清CRP表達(dá)上調(diào)明顯，風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間短，血清CRP雖有上調(diào)表達(dá)，但不明顯。經(jīng)免疫散射比濁法進(jìn)一步檢測(cè)，風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的CSU患者血清CRP水平高于健康對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間短的CSU患者血清CRP水平與健康對(duì)照組間無差異。這一結(jié)果提示，風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的CSU患者血清CRP可作為炎癥性標(biāo)志物，而在風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間短的CSU可能不具有炎癥性標(biāo)志物的價(jià)值。

綜上所述，本研究通過iTRAQ技術(shù)檢測(cè)風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間不同的CSU患者血清的差異蛋白，試圖尋找不同的風(fēng)團(tuán)形成過程中的蛋白質(zhì)差異，為研究CSU的發(fā)病機(jī)制和診療手段提供線索。研究結(jié)果提示，CSU患者血清CRP表達(dá)與風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間有關(guān)，風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的CSU患者血清CRP水平高于健康對(duì)照。血清CRP在風(fēng)團(tuán)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的CSU患者中具有炎癥性標(biāo)志物的意義。

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