基于基因組學(xué)的前列腺癌臨床精準(zhǔn)診療研究進(jìn)展

顧成元， 葉定偉

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

前列腺癌是美國(guó)男性最常見的腫瘤之一，位居男性惡性腫瘤死亡率的第2位[1-2]。雖然前列腺癌的治療已取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，已有多種用于治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌的新藥獲美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)[3]，但實(shí)現(xiàn)不同患者的精準(zhǔn)化個(gè)體治療仍存在極大的挑戰(zhàn)。Young等[4]提出應(yīng)在臨床研究設(shè)計(jì)中聯(lián)合生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)來分層篩選患者。前列腺癌的分子分型可能有助于提高治療效果，可以最大限度地減少無效治療時(shí)間和不良反應(yīng)等。高通量測(cè)序等新興技術(shù)的應(yīng)用有利于促進(jìn)前列腺癌的分子分型，并為精準(zhǔn)治療的發(fā)展提供了依據(jù)。因此，本文就目前基于基因組學(xué)的前列腺癌分子分型相關(guān)研究及臨床精準(zhǔn)診治研究進(jìn)展作一綜述，以切實(shí)提高前列腺癌的診治水平。

1 Ets基因融合及其尿液檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)前列腺癌的診斷價(jià)值

研究[5]采用生物信息學(xué)方法檢測(cè)基因芯片技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)前列腺癌中存在的基因融合，其中最常見的染色體重排涉及雄激素調(diào)控基因TMPRSS2的5′非翻譯區(qū)以及Ets轉(zhuǎn)錄因子(E26 transformation specific, Ets)家族成員Erg和Etv1。前列腺癌中這些基因融合的出現(xiàn)特異性近100%。進(jìn)一步的研究[6]顯示50%的前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)篩查和15%～35%未篩查前列腺癌患者中存在Ets相關(guān)基因融合。最常見的融合基因發(fā)生于TMPRSS2和Erg基因之間，約占Ets基因融合的90%?；仡櫺匝芯縖6]分析了基因融合與Gleason評(píng)分、病理分期和疾病特異性生存率的關(guān)系，但結(jié)果并不一致，可能由于研究人群和融合基因檢測(cè)方法差異所致。Prensner等[7]研究也認(rèn)為前列腺癌中融合基因的高度特異性具有潛在的診斷價(jià)值。

PSA檢測(cè)廣泛應(yīng)用于前列腺癌的篩查，但其局限性包括假陽性及對(duì)惰性前列腺癌的過度診斷。為改善以PSA為基礎(chǔ)的篩查，Tomlins等[8]開發(fā)了PSA聯(lián)合尿液檢測(cè)TMPRSS2-Erg融合基因和非編碼RNA PCA3的方法來預(yù)測(cè)前列腺癌可能性。該方法可減少良性前列腺增生患者接受穿刺活檢的比例，但需進(jìn)一步的前瞻性研究來證明其有效性和特異性。

2 前列腺癌精準(zhǔn)治療相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物的篩選與分析

分子標(biāo)志物有助于區(qū)別惰性和侵襲性前列腺癌。目前已出現(xiàn)數(shù)個(gè)有前景的分子標(biāo)志物，但受限于檢測(cè)方法不統(tǒng)一、研究樣本量小和驗(yàn)證研究缺乏等，尚未投入臨床應(yīng)用[7,9]。在前列腺癌前瞻性研究中需要延長(zhǎng)隨訪時(shí)間觀察復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也增加了研究的難度。新的高通量技術(shù)如蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)使系統(tǒng)篩選分子標(biāo)志物成為可能。近年來，核酸測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展使腫瘤基因組大規(guī)模測(cè)序[10-11]、拷貝數(shù)變異、體細(xì)胞點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)重排和基因表達(dá)改變的系統(tǒng)檢測(cè)成為現(xiàn)實(shí)[12-13]，為原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌基因組描繪了大致的輪廓。迄今為止，前列腺癌中最常見的分子生物學(xué)改變包括：雄激素受體(androgen receptor, AR)基因突變或擴(kuò)增[14]，Ets轉(zhuǎn)錄因子的基因重排[5]，以及磷酸酶和張力蛋白同源物[PTEN/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)]的丟失[15]。此外還包括發(fā)生頻率較低(<5%)的異常相互排斥基因變化，如Akt激活[16]、PIK3CA和Ras突變以及BRAF突變或融合[17-18]。

2.1 高頻基因組突變

2.1.1 Ets基因融合 由于前列腺癌中Ets基因融合的發(fā)生率約為50%，針對(duì)Ets基因融合的靶向治療將使大量患者獲益，但目前尚無直接針對(duì)此靶點(diǎn)的臨床試驗(yàn)。與其他涉及轉(zhuǎn)錄因子的基因融合一樣，相關(guān)靶向藥物的開發(fā)步履維艱。但是如合成致死或阻斷Ets轉(zhuǎn)錄因子的特定的蛋白間的相互作用等新技術(shù)在逐步完善之中[19]。同時(shí)，有研究[20-21]為研制以抑制聚ADP核糖聚合酶(PARP)或DNA-PK抑制的Ets轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)復(fù)合物為基礎(chǔ)的靶向藥物提供了理論基礎(chǔ)。此外，Barboro等[22]的研究結(jié)果顯示PARP活性可調(diào)控下游的AR信號(hào)通路，為AR、PARP聯(lián)合抑制提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。數(shù)項(xiàng)關(guān)于轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌 (castration-resistant prostate cancer, CRPC)的臨床試驗(yàn)評(píng)估了PARP和DNA-PK抑制劑以及聯(lián)合PARP和AR抑制的療效，對(duì)Ets融合狀態(tài)的理解將是研究的關(guān)鍵因素。

2.1.2 AR基因突變 目前前列腺癌基因組的數(shù)據(jù)表明超過50%的轉(zhuǎn)移性CRPCs出現(xiàn)AR的擴(kuò)增或突變。隨著下一代針對(duì)雄激素信號(hào)通路靶向藥物的開發(fā)，基因組測(cè)序策略將在確定潛在的耐藥機(jī)制方面發(fā)揮作用。以雄激素合成和受體為靶點(diǎn)的聯(lián)合治療療效仍未可知。

除了AR的突變和擴(kuò)增，Dehm等[23]報(bào)道多種AR剪接異構(gòu)體可導(dǎo)致雄激素信號(hào)通路的持續(xù)激活。這些異構(gòu)體導(dǎo)致C-末端的配體結(jié)合域的損失，保存包含DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄激活域的N-末端結(jié)構(gòu)域和反式激活從而發(fā)揮作用。盡管有研究[24-25]已報(bào)道了多個(gè)亞型，二代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了新的亞型，并且可能有助于理解其他潛在的耐藥機(jī)制。轉(zhuǎn)移性CRPC患者的AR剪接異構(gòu)體發(fā)生頻率尚未可知。因此，剪接體的相對(duì)意義以及它是否和其他耐藥機(jī)制如突變或擴(kuò)增等同時(shí)發(fā)生尚未明確，基因組改變?nèi)珉[蔽的剪接位點(diǎn)缺失可能會(huì)影響剪接過程[26]。雖然目前沒有以阻止AR剪接為靶點(diǎn)的治療，但已有研究[27]嘗試通過阻斷包含的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N-末端結(jié)構(gòu)域來抑制AR信號(hào)通路?？赏ㄟ^對(duì)轉(zhuǎn)移性CRPC患者進(jìn)行全面的基因組和轉(zhuǎn)錄組分析來研究AR剪接異構(gòu)體和二代抗雄藥物之間的相互作用。

2.1.3 PTEN和PI3K通路 PTEN是一種具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性參與細(xì)胞調(diào)控，并負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K-Akt-Mtor信號(hào)通路。因此，PTEN基因丟失或失活將導(dǎo)致PI3K信號(hào)通路的激活。多種腫瘤中廣泛出現(xiàn)PTEN丟失，為PI3K通路抑制劑治療腫瘤提供了理論依據(jù)[28]。在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)PTEN基因的雜合性缺失與其他癌基因可共同作用促進(jìn)前列腺腫瘤的生長(zhǎng)[29]。

在轉(zhuǎn)移性CRPC患者中，點(diǎn)突變、缺失或重排等各種形式的PTEN缺失發(fā)生率至少在50%以上。這還未包括將其他功能性的PTEN失活機(jī)制如表觀遺傳學(xué)改變或翻譯后調(diào)控。例如，Berger等[30]發(fā)現(xiàn)PTEN相互作用基因MAGI2的丟失或突變會(huì)導(dǎo)致功能性的PTEN失活。近期有研究[15]發(fā)現(xiàn)Erg融合與PTEN丟失導(dǎo)致雄激素信號(hào)通路激活之間的關(guān)系，在Erg融合的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中誘導(dǎo)PTEN雜合缺失將導(dǎo)致前列腺腫瘤的加速進(jìn)展。該結(jié)果與基因組數(shù)據(jù)一致，表明PTEN缺失和Ets融合并不是相互排斥的事件。Carver等[15]表明抑制AR或PI3K通路將導(dǎo)致另一條通路的激活，該研究提示在臨床試驗(yàn)中應(yīng)同時(shí)抑制AR和PI3K信號(hào)通路。

2.2 低頻和個(gè)體基因組突變

2.2.1 PIK3CA 最初在對(duì)結(jié)直腸腫瘤組織進(jìn)行外顯子測(cè)序后發(fā)現(xiàn)PIK3CA激活突變，隨后在乳腺癌和卵巢癌等腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[31]。PIK3CA熱點(diǎn)突變的功能研究[32]顯示PI3K通路下游激活包括Akt磷酸化等，同時(shí)伴有細(xì)胞增殖等表型改變。

在前列腺癌中，PIK3CA基因突變發(fā)生的頻率約為5%，拷貝數(shù)改變約為10%[33-34]，而PTEN缺失可達(dá)到50%。在研發(fā)PI3K抑制劑時(shí)，主要問題為PIK3CA基因突變與PTEN缺失的亞型之間是否存在功能的差異。此外，PI3K抑制劑治療PIK3CA突變前列腺癌后可能造成AR通路激活，因此對(duì)于這一亞型采取雙重抑制可能使患者獲益。

2.2.2 Akt Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K通路的組成部分。對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌組織中Akt1、Akt2和Akt3基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)Akt1存在激活突變[35]。該突變?cè)斐蒃17K氨基酸替換，在同源結(jié)構(gòu)域中影響蛋白定位，在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中改變了轉(zhuǎn)換效率。Boormans等[16]在188例前列腺癌中對(duì)Akt1基因進(jìn)行測(cè)序，激活的E17K突變的比例約為1.4%。

2.2.3 Ras-Raf通路 BRAF基因編碼Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)通路中的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。有研究[36]假設(shè)Ras通路的下游可能存在致癌激酶突變，研究者在一系列腫瘤細(xì)胞系中對(duì)多個(gè)Ras通路基因進(jìn)行外顯子測(cè)序，在BRAF激酶結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)一個(gè)頻發(fā)突變V600E。該激活突變可導(dǎo)致Raf激酶持續(xù)活化。目前Raf和MEK抑制劑用于BRAF突變黑素瘤中的臨床試驗(yàn)已取得積極的結(jié)果[2,37]，還有一些其他抑制劑用于BRAF基因突變腫瘤治療的研究在進(jìn)行中。

對(duì)于前列腺癌，北美前列腺癌基因組的研究[38-39]發(fā)現(xiàn)典型的BRAF和KRAS突變占1%～2%。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)除了點(diǎn)突變，涉及BRAF的基因融合發(fā)生率為1%～2%。體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這些基因重排導(dǎo)致Raf激酶的表達(dá)和固有活性產(chǎn)生變化，對(duì)于Raf抑制劑是敏感的。轉(zhuǎn)移性CRPC中KRAS基因融合發(fā)生率約為1%，體外敲除實(shí)驗(yàn)可抑制其發(fā)展[40]。因此，對(duì)于這種亞型的患者存在靶向治療的可能，這也提示了低頻驅(qū)動(dòng)基因突變?cè)黾恿酥委煹膹?fù)雜性，突變存在多樣性。

3 基于基因組學(xué)的前列腺癌新發(fā)基因組改變

最新的前列腺癌測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)許多潛在具有臨床轉(zhuǎn)化意義的新基因組改變。在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的兩項(xiàng)研究[38-39]中，高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)了高頻拷貝數(shù)變化和點(diǎn)突變。以下一些基因的改變值得注意：SPOP(13%)，F(xiàn)OXA1(3%～4%)，AURKA(神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌中約占40%)，MED12(4%～5%)和MAGI-2(1%)，每個(gè)都有特定的生物學(xué)功能和潛在的臨床意義。

SPOP基因編碼產(chǎn)物為泛素連接酶復(fù)合物的亞基，在原發(fā)性前列腺癌的外顯子測(cè)序研究[39]中發(fā)現(xiàn)其突變，突變頻率約為15%，其他研究中為6%～15%。有趣的是，SPOP突變主要影響蛋白的底物結(jié)合區(qū)域。SPOP突變與Est重排互相排斥，這意味著這兩種突變?cè)谇傲邢侔┌l(fā)生中是單獨(dú)的事件。體外實(shí)驗(yàn)中SPOP突變的轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖并無影響，但細(xì)胞侵襲增加。SPOP突變的前列腺癌可能代表一種新的分子亞型，有待進(jìn)一步的生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)其是否具有潛在的治療意義。

FOXA1基因編碼產(chǎn)物是一種參與AR共調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，其點(diǎn)突變影響DNA結(jié)合的叉頭域[41]。體外實(shí)驗(yàn)中FOXA1突變促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，負(fù)向調(diào)節(jié)雄激素信號(hào)通路。有研究[33]證實(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌分化前列腺癌中MYC和AURKA發(fā)生共同擴(kuò)增，并對(duì)AURKA抑制劑敏感。這為在AURKA擴(kuò)增的前列腺癌中應(yīng)用AURKA抑制劑治療提供了理論基礎(chǔ)，已成為通過測(cè)序技術(shù)將基礎(chǔ)研究結(jié)果迅速轉(zhuǎn)化為臨床試驗(yàn)的優(yōu)秀案例。

MED12編碼一種中介體復(fù)合物和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的亞基，在子宮肌瘤出現(xiàn)高頻突變。在前列腺癌中該突變可能影響周期蛋白依賴性激酶功能。CHD1編碼一種參與染色質(zhì)重塑的解旋酶DNA結(jié)合蛋白，在前列腺癌組織芯片和二代測(cè)序研究[38-39]中發(fā)現(xiàn)其純合缺失的發(fā)生頻率為8%～10%。在正常前列腺上皮細(xì)胞中，下調(diào)CHD1將導(dǎo)致侵襲性增加但并不轉(zhuǎn)化為癌。CHD1缺失與Ets重排是互相排斥的。

顯然這些新發(fā)現(xiàn)的意義有待進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來確定，這是通過基因組技術(shù)對(duì)前列腺癌進(jìn)行分子分型的進(jìn)步，有望在將來轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。

4 基于基因組學(xué)的前列腺癌靶向治療臨床進(jìn)展

前列腺癌基因組數(shù)據(jù)的臨床轉(zhuǎn)化工作已經(jīng)開展(表1)，目前進(jìn)行的有針對(duì)雄激素信號(hào)通路、PI3K通路激活以及Ets基因家族重排的臨床研究。2016年以Ets重排和表達(dá)為靶點(diǎn)的PARP抑制劑奧拉帕尼用于轉(zhuǎn)移性CRPC獲得FDA突破性療法資格。在既往接受過一種基于紫杉烷的化療及至少一種最新激素藥物治療的患者中，用于BRCA1/2或ATM基因突變轉(zhuǎn)移性CRPC治療。FDA授予突破性療法資格的標(biāo)準(zhǔn)是初步臨床證據(jù)顯示該藥物與現(xiàn)有治療藥物相比，可能對(duì)至少一種臨床重要的終點(diǎn)有實(shí)質(zhì)性改善。授予奧拉帕尼這一資格的決定基于Ⅱ期TOPARP-A試驗(yàn)的結(jié)果[42]，從總體來看，研究涉及的50例患者中，既往均接受過多西他賽化療。49例(98%)接受過阿比特龍和恩雜魯胺治療；29例(58%)接受過卡巴他賽治療；16例對(duì)奧拉帕尼治療有效(33%，95%CI 20～48)；12例接受治療超過6個(gè)月。經(jīng)二代測(cè)序確認(rèn)共有16例患者存在DNA修復(fù)基因相關(guān)缺陷(包括BRCA1/2、ATM和CHEK2基因)，其中14例(88%)對(duì)奧拉帕尼治療有反應(yīng)?？傮w耐受性良好，貧血和乏力是最常見的不良事件，可見PARP抑制劑奧拉帕尼對(duì)于那些常規(guī)治療方案無效且DNA修復(fù)基因存在缺陷的CRPC患者有很好的治療效果[42]。隨著第二代AR拮抗劑的研究逐漸深入，目前焦點(diǎn)集中在疾病進(jìn)展時(shí)雄激素通路是否已完全阻斷以及耐藥的機(jī)制。此外，以Ets融合和雄激素受體N-端為靶點(diǎn)的臨床前研究工作正在逐步開展。由于Ets融合與AR異常的發(fā)生頻率較高，這些潛在的治療方法將適用于大多數(shù)晚期前列腺癌患者。

表1 前列腺癌靶向治療臨床試驗(yàn)一覽表

基于聯(lián)合阻斷PI3K通路和雄激素信號(hào)通路的基礎(chǔ)研究結(jié)果，已經(jīng)開展相應(yīng)的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證這些假設(shè)。然而大部分此類試驗(yàn)未常規(guī)納入綜合分子分型，如PTEN和PI3K信號(hào)通路異常。治療前和治療后分別取活檢進(jìn)行系統(tǒng)分子分型將有助于發(fā)現(xiàn)和證實(shí)預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物將使哪些患者獲益。此外，基于活檢的分子分型將提供組織信息為分析耐藥機(jī)制并為下一步治療或聯(lián)合治療提供依據(jù)。

對(duì)于具有低頻和個(gè)體化變異的患者(1%～2%)，地域和費(fèi)用將對(duì)臨床試驗(yàn)定期訪視造成嚴(yán)重的困難。此外單中心研究的入組速度對(duì)制藥企業(yè)來說可能過于緩慢?？赡艿慕鉀Q方法是篩選時(shí)不局限于單個(gè)基因而是以信號(hào)通路為單位，并且入組任何病理類型的轉(zhuǎn)移性前列腺癌。盡管這樣的研究人群將出現(xiàn)異質(zhì)性，但對(duì)于以探索為目的的研究是可以接受的。

為了促進(jìn)這些罕見驅(qū)動(dòng)突變患者的分子分型發(fā)展，研究人員已經(jīng)開展了包括對(duì)轉(zhuǎn)移性疾病組織活檢進(jìn)行二代測(cè)序等在內(nèi)的腫瘤測(cè)序工作。臨床腫瘤測(cè)序工作包括對(duì)腫瘤進(jìn)行全基因組、外顯子組或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過多學(xué)科合作對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)，提供具有臨床操作性的結(jié)果反饋。近期有兩個(gè)多中心研究[26]獲得資助對(duì)轉(zhuǎn)移性CRPC和黑素瘤患者進(jìn)行臨床腫瘤測(cè)序工作。這些工作將促進(jìn)以分子分型為基礎(chǔ)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念逐步推廣，尋找新的分子分型，有助于理解靶向治療的耐藥機(jī)制。

5 未來和挑戰(zhàn)

雖然前列腺癌基因組數(shù)據(jù)逐步轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，但僅采用高通量測(cè)序技術(shù)也有一定的局限性，包括組織活檢、腫瘤微環(huán)境中，表觀遺傳學(xué)和異質(zhì)性等也是需要考慮的因素。與其他上皮性腫瘤相比，相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者僅有骨轉(zhuǎn)移灶，這對(duì)于腫瘤組織活檢是相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。這對(duì)于組織采集和測(cè)序方法處理產(chǎn)生了限制。高達(dá)一半的骨組織活檢取材量不足以用于測(cè)序分析。這些測(cè)序方法主要針對(duì)腫瘤細(xì)胞，可能忽略了腫瘤與宿主之間的相互作用，包括腫瘤微環(huán)境和免疫應(yīng)答[43]。前列腺癌本身具有多病灶異質(zhì)性的特點(diǎn)，關(guān)鍵問題是多個(gè)轉(zhuǎn)移性病灶是否同樣具有異質(zhì)性。雖然這些病灶很可能都是驅(qū)動(dòng)基因突變形成的優(yōu)勢(shì)克隆，但治療方法和療效是否將受到耐藥性帶來的異質(zhì)性所影響目前仍不清楚。未來測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，如單細(xì)胞測(cè)序等將有助于探索微環(huán)境的特征。而高通量測(cè)序的臨床應(yīng)用主要集中在DNA和RNA水平的變異，在表觀遺傳分析層面的分析尚未廣泛開展?？捎糜陬A(yù)測(cè)預(yù)后的表觀遺傳變異和相應(yīng)治療非常有限。隨著表觀遺傳學(xué)預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物和相應(yīng)治療的發(fā)展和測(cè)序技術(shù)成本的逐漸下降，表觀遺傳分析也將加入到基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中。

盡管存在局限性，未來十年中基因組分析仍將廣泛應(yīng)用于晚期前列腺癌的治療。前列腺癌的分子特征促進(jìn)了個(gè)性化腫瘤治療臨床試驗(yàn)的發(fā)展，前列腺癌基因組學(xué)的轉(zhuǎn)化研究將促進(jìn)臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的創(chuàng)新和尖端基礎(chǔ)科學(xué)的臨床應(yīng)用。

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