miR-145對人角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響

李璟蓉 王建琴 方銳華 曾仁山 莫金雪 郭云龍 賈淑青

miR-145對人角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響

李璟蓉 王建琴 方銳華 曾仁山 莫金雪 郭云龍 賈淑青

目的 研究miR-145對人角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞增殖、細胞周期及凋亡的調(diào)控效應(yīng)。方法化學(xué)合成miR-145的模擬物，采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法過表達miR-145。采用實時PCR方法檢測miR-145的表達。MTS方法檢測過表達miR-145對HaCaT細胞增殖的影響。流式細胞儀分析過表達miR-145對細胞周期及凋亡的影響。采用熒光素酶實驗，實時PCR和Western印跡鑒定NRAS是否為miR-145的靶基因。結(jié)果 與陰性對照（NC）mimics轉(zhuǎn)染組相比，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組miR-145表達水平上調(diào)（85.00±1.21）倍，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=115.90，P＜0.001）。轉(zhuǎn)染 miR-145 mimics有抑制 HaCaT細胞的增殖作用（F=8.76，P=0.008）；轉(zhuǎn)染后的時間因素（24、48、72、96 h）對細胞有影響（F=17.85，P＜ 0.001），轉(zhuǎn)染 mimics和培養(yǎng)時間之間不存在交互作用（F=1.21，P=0.18）。與NC mimics轉(zhuǎn)染組相比，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組的早期凋亡、晚期凋亡細胞比例均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（18.9%±4.1%比4.3%±1.2%，t=7.126，P＜0.01；9.3%±2.3%比3.6%±1.6%，t=12.38，P＜0.01）。與NC mimics轉(zhuǎn)染組相比，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組HaCaT細胞的G2及S期細胞比例均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（6.26%±1.2%比19.36%±3.45%，t=7.610，P=0.017；7.91%±1.3%比18.56%±5.23%，t=7.230，P=0.019），而處于G1期的細胞比例升高，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（85.83%±5.2%比62.08%±6.23%，t=11.78，P=0.007）。與NCmimics聯(lián)合psi-CHECK2-NRAS-wild組相比，在293T細胞中共轉(zhuǎn)染miR-145 mimics和psi-CHECK2-NRAS-wild質(zhì)粒，其熒光素酶值明顯下降，miR-145可抑制含NRAS mRNA 3′UTR報告基因的熒光素酶表達（t=11.09，P=0.008）；而將NRAS mRNA 3′UTR報告基因上miR-145的結(jié)合位點進行突變后，轉(zhuǎn)染miR-145 mimics對含NRAS mRNA 3′UTR報告基因的熒光素酶表達無明顯的影響（P＞0.05）。實時PCR和Western印跡結(jié)果表明，過表達miR-145 mimics后，NRAS mRNA表達水平未出現(xiàn)明顯變化（P＞0.05），對NRAS蛋白水平的表達有明顯的抑制（1.52±0.07比0.20±0.02，t=28.43，P＜0.01）。結(jié)論 miR-145可能通過NRAS影響HaCaT細胞的周期從而抑制細胞的增殖，同時促進HaCaT細胞的凋亡。

角蛋白細胞；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡；尖銳濕疣；HaCaT細胞；miR-145；NRAS

尖銳濕疣的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的調(diào)控過程。microRNA（miRNA）是一類長度在21～25 nt的非編碼RNA，其作用方式之一是通過結(jié)合在靶基因的3′UTR的位置抑制靶基因的翻譯過程，影響靶基因的蛋白表達［1］。研究表明，miRNA通過調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡和增殖相關(guān)基因參與調(diào)節(jié)細胞的周期、凋亡和增殖過程［2-4］。我們的前期研究［5］表明，miR-145 在尖銳濕疣組織中顯著性低表達，提示該miRNA可能在調(diào)控尖銳濕疣的發(fā)生發(fā)展中起作用。另外，我們通過信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-145可能參與調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路［5］。本文中，我們研究 miR-145是否調(diào)節(jié)HaCaT細胞的增殖、凋亡和周期變化，并驗證MAPK信號通路的關(guān)鍵基因NRAS（neuroblastoma RAS viral（v-ras）oncogene homolog）是否為miR-145的靶基因。

材料與方法

一、材料與試劑

HaCaT和293T細胞（武漢典藏培養(yǎng)物保藏中心）培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Hyclone公司），并添加100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素（美國Sigma公司）。psi-CHECK2報告基因載體、熒光素酶檢測系統(tǒng)（美國Promega公司）、脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）及 TRIzol（美國Life technologies公司）；NRAS抗體及二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；SYBR Green PCR Master Mix（日本 TaKaRa公司）；miR-145及內(nèi)參照U6 PCR引物（廣州銳博生物科技有限公司）；熒光定量PCR儀（PRISM?7500 Sequence Detection System，美國ABI公司）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：HaCaT細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下進行常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當天，細胞匯合度約為50%～60%，轉(zhuǎn)染過程根據(jù)Lipofectamine 2000說明書進行。

2.內(nèi)鹽法（MTS）檢測細胞增殖：培養(yǎng)HaCaT細胞，分別轉(zhuǎn)染miR-145 mimics及陰性對照（NC）mimics，每組設(shè)置 5 個平行樣。分別于 0、24、48、72 h各時間點的細胞中加入MTS，比例為1∶10，即100 μl培養(yǎng)液加入10 μl檢測液。在孵育4 h后，酶標儀讀板，MTS檢測法讀取A490數(shù)據(jù)。

3.流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期：培養(yǎng)HaCaT細胞，分別轉(zhuǎn)染miR-145 mimics及NC mimics，然后用胰酶消化細胞，再用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞，離心沉淀細胞，棄上清液。

細胞凋亡的檢測：將細胞輕輕重懸于預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中，使其密度約為1×106/ml。加入1.25μl Annexin V-FITC，室溫（18～24℃）避光反應(yīng)15 min。室溫1 000×g離心5 min，去除上清液。將細胞用0.5 ml預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸，加入10 μl碘化丙錠，將樣本放于冰上避光保存，并立即用流式細胞儀檢測分析。

細胞周期檢測：以0.5 ml PBS重懸細胞，迅速打入3.5 ml 70%預(yù)冷的乙醇中，吹打混勻。300×g離心10 min，棄上清液，PBS洗滌細胞3次以去除殘留的乙醇。用含有0.2 mg RNase A的1 ml碘化丙錠/Triton X-100染色液（20 μg碘化丙錠/0.1%Triton X-100）重懸細胞，37℃染色15 min。立即用流式細胞儀檢測分析。

4.熒光素酶活性檢測：采用Targetscan（www.targetscan.org/）和 miRanda（www.microrna.org）在 線預(yù)測軟件預(yù)測miR-145與NRAS結(jié)合位點。常規(guī)PCR 方法擴增 NRAS 3′UTR（NM_002524.4）的全長序列，成功構(gòu)建熒光素酶報告基因載體，并命名為psi-CHECK2-NRAS-wild。利用PCR點突變的方法構(gòu)建miR-145結(jié)合位點突變的熒光素酶報告基因載體，并命名為psi-CHECK2-NRAS-mut。實驗分組：miR-145 mimics聯(lián)合 psi-CHECK2-NRAS wild組、NC mimics聯(lián)合 psi-CHECK2-NRAS wild組、miR-145 mimics聯(lián)合psi-CHECK2-NRAS mut組、NC mimics聯(lián)合psi-CHECK2-NRAS mut組。轉(zhuǎn)染293T細胞48 h后，按照熒光素酶檢測試劑盒的步驟檢測各組的熒光值。

5.熒光定量PCR檢測NRAS及miR-145的表達：轉(zhuǎn)染24 h收集細胞樣品，TRizol提取細胞總RNA。頸環(huán)法和oligo dT法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA分別用于miR-145和NRAS檢測；SYBR Green法進行PCR檢測。NRAS的上游引物為：5′-TCTGGAGCAG TGCTACTCTGT-3′，下游引物為：5′-TCACTGCCAG TCACAGACAT-3′。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃30 s變性、55℃30 s退火、72℃30 s延伸進行40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次。

6.Western印跡檢測NRAS表達：轉(zhuǎn)染48 h收集細胞樣品，RIPA裂解液裂解細胞。BCA法測定蛋白濃度，按照總蛋白一致的原則上樣，10%分離膠進行SDS-PAGE電泳；100 V濕轉(zhuǎn)50 min，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；TBST洗10 min 3次，NRAS一抗（1∶1 000）室溫孵育 1 h；TBST洗 10 min 3次，兔抗鼠（1∶4 000）室溫孵育1 h；TBST洗10 min 3次；暗室曝光。

7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計：采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用±s，細胞增殖實驗采用重復(fù)測量方差分析，其余檢測采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-145對 HaCaT細胞增殖的影響

細胞轉(zhuǎn)染后，采用熒光定量PCR檢測miR-145的表達水平，與NC mimics轉(zhuǎn)染組相比，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組miR-145的表達水平上調(diào)（85±1.21）倍，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=115.90，P＜ 0.0001）。采用 MTS 檢測轉(zhuǎn)染后 24、48、72、96 h miR-145對HaCaT細胞增殖能力的影響，結(jié)果見表1。重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-145 mimics對抑制HaCaT細胞的增殖作用有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.76，P=0.008）。轉(zhuǎn)染后的時間因素有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.85，P＜0.001），且這種抑制作用隨時間的延長而愈加明顯。轉(zhuǎn)染mimics和培養(yǎng)時間之間不存在交互作用（F=1.21，P=0.18），說明時間因素的作用不隨分組而改變。

二、miR-145對HaCaT細胞凋亡的影響

采用流式細胞儀對miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組和NC mimics轉(zhuǎn)染組細胞凋亡情況分別進行檢測。結(jié)果見圖1。NC mimics轉(zhuǎn)染組的早期凋亡、晚期凋亡細胞比例分別為4.3%±1.2%和3.6%±1.6%；miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組分別為18.9%±4.1%和9.3%±2.3%。與NC mimics轉(zhuǎn)染組相比，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組晚期凋亡細胞的比例明顯增加（t=12.38，P=0.0065），尤其是早期凋亡的細胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.13，P=0.0021），細胞總凋亡比例明顯增加（t=20.50，P=0.0024）。

三、miR-145對HaCaT細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果見圖2。miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組細胞G1、G2及S期細胞比例與NC mimics轉(zhuǎn)染組比較（85.83%±5.20%比62.08%±6.23%，t=11.78，P=0.007；6.26% ±1.20%比 19.36% ±3.45%，t=7.61，P=0.017；7.91% ± 1.30% 比 18.56% ±5.23%，t=7.23，P=0.019），HaCaT 細胞處于 G2、S期的細胞比例均明顯降低，而G1期細胞比例升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

四、miR-145靶基因的分析

表1 MTS檢測轉(zhuǎn)染miR-145 mimics后對HaCaT細胞增殖的影響（A490，±s）

表1 MTS檢測轉(zhuǎn)染miR-145 mimics后對HaCaT細胞增殖的影響（A490，±s）

注：n=5。a：重復(fù)測量方差分析

組別 0 24 h 48 h 72 h 96 h NC mimics轉(zhuǎn)染組 0.21±0.02 0.46±0.03 0.86±0.04 1.01±0.06 1.21±0.08 miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組 0.22±0.03 0.34±0.05 0.51±0.08 0.66±0.08 0.80±0.09 P值a ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖1 流式細胞儀檢測miR-145對HaCaT細胞凋亡的影響 miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組細胞總凋亡比例較NC mimics轉(zhuǎn)染組明顯增加

通過miRanda和Targetscan在線預(yù)測軟件預(yù)測分析出miR-145 mimics和NRAS的3′UTR存在結(jié)合位點，結(jié)合信息及突變質(zhì)粒的信息見圖3。雙熒光報告基因結(jié)果顯示，與NC mimics聯(lián)合psi-CHECK2-NRAS-wild組相比，在293T細胞中共轉(zhuǎn)染miR-145 mimics和psi-CHECK2-NRAS-wild質(zhì)粒，其熒光素酶值明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.09，P=0.008）。而將 NRAS mRNA 3′UTR 報告基因上miR-145的結(jié)合位點進行突變后，轉(zhuǎn)染miR-145 mimics對含NRAS mRNA 3′UTR報告基因的熒光素酶表達無明顯影響（t=0.53，P=0.647），見圖4。以上結(jié)果說明，miRNA靶基因預(yù)測軟件預(yù)測的NRAS mRNA 3′UTR上的miR-145結(jié)合位點可以和miR-145結(jié)合，從而影響熒光素酶的表達。

圖3 miR-145與NRAS的結(jié)合信息及NRAS 3′UTR的突變信息

圖4 轉(zhuǎn)染miR-145 mimics對含NRAS mRNA 3′UTR報告基因

采用熒光定量PCR和Western印跡法檢測過表達miR-145 mimics對NRAS表達的影響：過表達miR-145 mimics后，NRAS mRNA 的表達水平未出現(xiàn)明顯變化（P＞0.05）。圖 5示，通過內(nèi)參GAPDH校正后，NC mimics轉(zhuǎn)染組NRAS的相對表達量是1.52 ± 0.07，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組NRAS的相對表達量是0.20±0.02。過表達miR-145 mimics對NRAS的蛋白水平的表達有明顯的抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=28.43，P=0.0012）。

討 論

研究表明［5］，miR-145在尖銳濕疣組織樣本中呈顯著低表達，提示miR-145可能參與尖銳濕疣的發(fā)生發(fā)展過程。為進一步研究miR-145在尖銳濕疣的作用，我們選擇HaCaT細胞作為研究對象［6］。

目前研究認為，引起尖銳濕疣的HPV感染與宮頸癌、鱗狀細胞癌、陰莖癌、女性外陰癌等惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［7-8］。Nambaru 等［9］對 121 例宮頸癌患者的標本進行研究，在HPV整合位點附近發(fā)現(xiàn)了53個miRNA，其中39個miRNA與腫瘤相關(guān)，25個miRNA在宮頸癌中被報道。miR-145在宮頸癌組織中顯著性低表達［10］。在Hela細胞中過表達miR-145可以顯著性抑制細胞的增殖［11］。Sachdeva 等［12］的研究表明，miR-145在體內(nèi)和體外環(huán)境下均可抑制宮頸癌細胞的增殖。

圖5 Western印跡檢測NRAS蛋白水平的表達 miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組相對于NC mimics轉(zhuǎn)染組，其NRAS蛋白水平下降

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，miR-145不僅可以抑制HaCaT細胞增殖，而且可以影響HaCaT細胞的細胞周期。結(jié)果顯示，過表達miR-145可以明顯抑制細胞從G1到S期的過渡，使處于S期的細胞數(shù)量明顯減少。另一研究結(jié)果顯示，在黑素瘤細胞中，過表達miR-145可以阻礙細胞從G1期到S期的過渡，從而抑制細胞的增殖［13］。提示，miR-145可能通過影響細胞周期的方式影響HaCaT細胞的增殖。另外，我們發(fā)現(xiàn)，miR-145還可以促進細胞凋亡。由于細胞周期和細胞增殖、凋亡屬于不同的信號通路調(diào)控，我們可以認為，miR-145的靶基因應(yīng)該不止一個。通過miRNA靶基因預(yù)測軟件分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-145的潛在靶基因多達幾百個。

我們通過hsa-mir-145靶基因信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-145可能參與MAPK信號通路的調(diào)節(jié)，而MAPK信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞凋亡方面都發(fā)揮重要的作用，其中，NRAS是MAPK信號通路的關(guān)鍵基因［5］。本研究證明，NRAS是miR-145的靶基因，且miR-145可以通過影響NRAS翻譯的方式影響NRAS蛋白水平的表達。提示我們miR-145可能通過影響NRAS的表達從而影響MAPK信號。

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2014-10-13）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

Effects of miR-145 on the proliferation,apoptosis and cell cycle of a human keratinocyte cell line HaCaT

Li Jingrong*,Wang Jianqin,Fang Ruihua,Zeng Renshan,Mo Jinxue,Guo Yunlong,Jia Shuqing.*Department of Dermatology,Nansha Central Hospital of Guangzhou,Guangzhou 511457,China

Wang Jianqin,Email：jianqinwang@tom.com

ObjectiveToinvestigatetheregulatoryeffectsofmiR-145ontheproliferation,cellcycle andapoptosis of a human keratinocyte cell line HaCaT.MethodsmiR-145 mimics and negative control（NC）mimics were chemically synthesized and then transiently transfected into HaCaT cells respectively.After additional culture for different durations,real-time PCR was performed to determine the expression level of miR-145,MTS assay to estimate cell proliferation,and flow cytometry to detect cell apoptosis and cycle.Luciferase assay,real-time PCR and Western blot were conducted to determine whether NRAS was the target gene of miR-145.ResultsThe miR-145 expression level in miR-145 mimictransfected cells increased by 85.00±1.21 folds compared with NC mimic-transfected cells（t=115.90,P＜0.0001）.The transfection with miR-145 mimics significantly inhibited the proliferation of HaCaT cells（F=8.76,P=0.008）,and the inhibitory effect significantly varied with the duration（24 － 96 hours）of culture after transfection,with no interaction effect between the transfection with miR-145 mimics and culture duation （F=1.21,P=0.18）.Compared with NC mimic-transfected cells,those transfected with miR-145 mimics showed a significant increase in the proportion of early apoptotic cells（18.9%±4.1%vs.4.3%±1.2%,t=7.126,P＜0.01）,late apoptotic cells（9.3% ±2.3%vs.3.6% ±1.6%,t=12.38,P＜0.01）,G1-phase cells（85.83% ±5.2%vs.62.08% ±6.23%,t=11.78,P=0.007）,but a significant decrease in the percentage of G2-phase cells（6.26%±1.2%vs.19.36%±3.45%,t=7.610,P=0.017）and S-phase cells（7.91%±1.3%vs.18.56%±5.23%,t=7.230,P=0.019）.As luciferase assay showed,luciferase activity was significantly lower in HaCaT cells cotransfected with miR-145 mimics and a recombinant luciferase reporter vector psi-CHECK2-NRAS-wild carrying the wild-type 3′UTR of NRAS than in those cotransfected with NC mimics and the vector psi-CHECK2-NRAS-wild （t=11.09,P=0.008）,but similar between cells cotransfected with miR-145 mimics and a recombinant luciferase reporter vector psi-CHECK2-NRAS-mut carrying the mutant-type 3′UTR of NRAS and those cotransfected with NC mimics and the vector psi-CHECK2-NRAS-mut（P＞ 0.05）.Real-time PCR and Western blot revealed that the overexpression of miR-145 mimics had no significant effect on NRAS mRNA expression（P＞ 0.05）,but significantly inhibited NRAS protein expression（1.52±0.07 vs.0.20±0.02,t=28.43,P＜0.01）.ConclusionmiR-145 might inhibit proliferation and promote apoptosis of HaCaT cells by influencing cell cycle via NRAS.

Keratinocytes;Cell proliferation;Cell cycle;Apoptosis;Condylomata acuminata;HaCaT cells;miR-145;NRAS

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.014

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（B2013339）

511457廣州市南沙中心醫(yī)院皮膚科（李璟蓉、王建琴、莫金雪、郭云龍、賈淑青）；廣州市第一人民醫(yī)院皮膚科（方銳華、曾仁山）

王建琴，Email：jianqinwang@tom.com