超高效合相色譜對(duì)芳樟醇對(duì)映體的拆分及熱力學(xué)研究

王 波，閆 衡，王肅軍，劉阿靜，楊盛鑫，周 圍，，*

(1．甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局 綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000;2．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070;3．西北師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

手性是自然界普遍存在的現(xiàn)象，隨著科學(xué)的發(fā)展，對(duì)光學(xué)純物質(zhì)的需求量越來(lái)越大，手性對(duì)映體分離日益引起人們的關(guān)注。近年來(lái)手性香精香料的研究與開(kāi)發(fā)已成為世界各大香精香料公司主要開(kāi)發(fā)的方向和焦點(diǎn)之一［1］。因此研究手性化合物的分離對(duì)于手性香精香料的開(kāi)發(fā)具有非常重要的意義。

芳樟醇(Linalool)又名沉香醇、芫荽醇、里那醇等，學(xué)名為3，7-二甲基-1.6-辛二烯-3-醇，分子式為C10H18O，分子量154.24，屬于鏈狀萜烯類，具有鈴蘭香氣，幾乎不溶于水和甘油，溶于丙二醇、非揮發(fā)性油和礦物油，混溶于乙醇和乙醚，具有左旋和右旋兩種光學(xué)異構(gòu)體。在不同來(lái)源的精油中，多為異構(gòu)體混合物，消旋體存在于香紫蘇油、茉莉油和合成芳樟醇中，右旋體存在于芫荽油、某些品種的香紫蘇油中，左旋體存在于芳樟葉油、黃樟油、熏衣草油、玫瑰木油中。當(dāng)今“芳香療法”和“芳香養(yǎng)生”廣泛使用的各種精油中，芳樟葉油被公認(rèn)為具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜、抗菌、止痛、松弛肌肉等作用。已有研究表明，左旋體的鎮(zhèn)靜作用明顯，而右旋體則相反，故對(duì)芳樟醇進(jìn)行手性拆分而得到光學(xué)純物質(zhì)具有重要意義［2－3］。

目前，高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)和超臨界流體色譜(SFC)等方法在手性化合物分離領(lǐng)域均發(fā)揮著重要作用。其中，HPLC有大量的手性固定相(CSPs)可供選擇，是最通用的色譜分離技術(shù)。超高效合相色譜法(Ultra performance convergence chromatography，UPC2)除了具有傳統(tǒng)超高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)外，還可與超臨界流體色譜技術(shù)結(jié)合，以超臨界流體CO2為流動(dòng)相主體，依靠流動(dòng)相的溶劑化能力進(jìn)行分離分析［4－6］。UPC2能夠通過(guò)精確調(diào)節(jié)流動(dòng)相強(qiáng)度、壓力和溫度，獲得所需的系統(tǒng)分辨率和選擇性，可對(duì)待測(cè)物的保留和分離進(jìn)行有效調(diào)控，與常規(guī)的HPLC，GC和SFC技術(shù)相比，具有體系重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好、分離效率高等特點(diǎn)，有效彌補(bǔ)了HPLC，GC和SFC在分離手性物質(zhì)方面的不足。近年來(lái)，采用HPLC，SFC技術(shù)分離手性化合物的研究已有較多報(bào)道［7－16］，對(duì)于芳樟醇的拆分也有不少報(bào)道［17－21］，但UPC2技術(shù)應(yīng)用于芳樟醇對(duì)映體分離尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將UPC2技術(shù)應(yīng)用于芳樟醇對(duì)映體的拆分，分離過(guò)程中有機(jī)溶劑的用量極少，是一種快速、簡(jiǎn)單、環(huán)保、高效的分離方法。該研究為芳樟醇手性化合物的分離開(kāi)拓了一種新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效合相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，配有Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);MS3渦旋儀(德國(guó)IKA公司);CAPCELL PAK Chiral CD－Ph色譜柱(150 mm×3.0 mm，4.6 μm，日本資生堂);移液槍(美國(guó) Thermo Electron 公司，100～1 000 μL，20～100 μL)。

工業(yè)芳樟醇(純度90%，上海申寶香精香料有限公司);CO2(純度99.997%，蘭州匯能公司)，甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷(色譜純，德國(guó)Merck公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液:精確稱取芳樟醇100 μL，用正己烷溶解并定容至100 mL，配成0.1%的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃下冷藏待用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移1 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用正己烷定容至10 mL，稀釋為0.01%的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下冷藏待用。

1.3 超高效合相色譜條件

色譜柱:CAPCELL PAK Chiral CD－Ph(150 mm×3.0 mm，4.6 μm);流動(dòng)相:A為CO2，B為乙腈;流速1.2 mL/min;進(jìn)樣量3 μL;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm;動(dòng)態(tài)背壓(ABPR):1 700 psi。等度洗脫:CO2與乙腈的體積比為97∶3。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性劑對(duì)分離的影響

由于在超高效合相色譜中，流速對(duì)手性化合物的分離基本無(wú)影響［22］，故實(shí)驗(yàn)流速設(shè)為1.2 mL/min。在β-環(huán)糊精鍵合固定相的手性分離中，選擇不同的有機(jī)改性劑，可以改變對(duì)映體分離的選擇性。UPC2中有機(jī)改性劑通常為甲醇或乙腈。在其它色譜條件不變的情況下，考察流動(dòng)相分別選擇甲醇或乙腈為有機(jī)改性劑時(shí)對(duì)芳樟醇手性分離的影響。結(jié)果顯示，以甲醇作為有機(jī)改性劑時(shí)，由于甲醇具有較大的極性，芳樟醇不能得到分離。而乙腈作為有機(jī)改性劑時(shí)，芳樟醇對(duì)映體可得到較好的分離，且峰形尖銳。因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為有機(jī)改性劑。

2.2 動(dòng)態(tài)背壓(ABPR)對(duì)分離的影響

超高效合相色譜中，動(dòng)態(tài)背壓(ABPR)也是影響分離過(guò)程的重要因素之一，其主要作用是控制CO2在整個(gè)操作過(guò)程中處于超臨界流體狀態(tài)。在不同的動(dòng)態(tài)背壓下，CO2超臨界流體對(duì)樣品有著不同的溶解能力。當(dāng)背壓升高時(shí)，超臨界流體密度會(huì)增大，溶劑化能力增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)考察了背壓在1 500～2 000 psi范圍內(nèi)時(shí)對(duì)樣品分離度的影響(見(jiàn)表1)。

表1 動(dòng)態(tài)背壓對(duì)芳樟醇對(duì)映體分離的影響Table 1 Effect of active back pressure(ABPR)on separation parameters of linalool

結(jié)果顯示，當(dāng)ABPR為1 650 psi時(shí)，分離度最大達(dá)1.02，隨著背壓升高至2 000 psi，芳樟醇對(duì)映體的分離度逐漸減小。這是由于隨著動(dòng)態(tài)背壓的升高，CO2超臨界流體的密度、黏度隨之增加，柱壓升高，溶劑化能力改變所致。而1 650 psi時(shí)，CO2超臨界流體的密度、溶劑化能力最適合芳樟醇對(duì)映體的分離。綜合考慮保留時(shí)間、峰形及色譜柱壓力，實(shí)驗(yàn)選擇動(dòng)態(tài)背壓為1 700 psi。

2.3 溫度對(duì)分離的影響

柱溫是影響色譜分離對(duì)映體過(guò)程的重要因素，柱溫的變化不僅影響對(duì)映體在固定相上吸附－解離的速度，還會(huì)影響對(duì)映選擇性，甚至可能導(dǎo)致固定相構(gòu)型發(fā)生變化，從而影響溶質(zhì)與手性固定相間的相互作用，使光學(xué)異構(gòu)體的洗脫次序出現(xiàn)反轉(zhuǎn)。柱溫對(duì)分離的影響主要有:①隨著柱溫的升高，超臨界流體的密度降低，樣品分子的保留增強(qiáng)，容量因子增加;②隨著柱溫的升高，樣品分子的傳質(zhì)速率增加，有助于從固定相表面脫附進(jìn)入流動(dòng)相中，容量因子減?。?3］。本實(shí)驗(yàn)在保持其它色譜條件不變的前提下，考察了柱溫在30～55℃范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)目標(biāo)物分離的影響(見(jiàn)表2)。從表2可知，芳樟醇對(duì)映體的容量因子(k')、分離度(Rs)和選擇因子(α)隨著柱溫升高而逐漸減小，即保留時(shí)間縮短，分離效果降低，這說(shuō)明芳樟醇對(duì)映體的分離主要受第二方面的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳柱溫為30℃。

表2 溫度對(duì)芳樟醇對(duì)映體分離的影響Table 2 Effect of temperature on linalool separation parameters

2.4 進(jìn)樣量對(duì)分離的影響

與傳統(tǒng)的超高效液相色譜流動(dòng)相不同，UPC2主要以CO2超臨界流體為流動(dòng)相，進(jìn)樣量的改變會(huì)明顯影響CO2超臨界流體的溶劑化能力，進(jìn)而影響色譜峰形及目標(biāo)物之間的分離度。當(dāng)芳樟醇體積分?jǐn)?shù)為0.01%時(shí)，考察了進(jìn)樣量分別為1，3，5，8，10 μL時(shí)的分離效果，結(jié)果表明，芳樟醇對(duì)映體的分離度隨著進(jìn)樣量的增加而減小，且峰形逐漸不對(duì)稱，當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，芳樟醇對(duì)映體已無(wú)法完成分離。故本實(shí)驗(yàn)在芳樟醇體積分?jǐn)?shù)為0.01%時(shí)，選擇最佳進(jìn)樣量為3 μL。最終確定分離條件為:紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，改性劑為乙腈，流動(dòng)相流速為1.2 mL/min，柱溫30℃，動(dòng)態(tài)背壓1 700 psi，芳樟醇體積分?jǐn)?shù)為0.01%時(shí)，最佳進(jìn)樣量3 μL;在上述優(yōu)化條件下，芳樟醇對(duì)映體的保留時(shí)間分別為1.33 min和1.46 min，總運(yùn)行時(shí)間3 min，圖1為芳樟醇對(duì)映體的拆分色譜圖。

圖1 芳樟醇對(duì)映體的拆分色譜圖Fig.1 Chromatogram of linalool separation

2.5 對(duì)映體分離過(guò)程中的熱力學(xué)參數(shù)

由色譜圖及分離參數(shù)可以看出，在對(duì)芳樟醇對(duì)映體分離的過(guò)程中，色譜柱柱溫對(duì)分離效果有很大影響，對(duì)UPC2法分離檢測(cè)芳樟醇對(duì)映體在色譜柱上分離的熱力學(xué)研究可進(jìn)一步搜索芳樟醇對(duì)映體在色譜柱上的分離保留機(jī)理，有助于建立及優(yōu)化對(duì)映體的分離檢測(cè)條件，并對(duì)芳樟醇對(duì)映體的進(jìn)一步研究有著重要意義。利用色譜法分離光學(xué)異構(gòu)體的過(guò)程中，溶質(zhì)的容量因子(k')與柱溫的關(guān)系以及對(duì)映體分離因子(α)與柱溫的相關(guān)性可用Gibbs－Holmholtz方程(公式1)和Van't Hoff方程(公式2)［24］獲得:

式中，k'為溶質(zhì)的容量因子，ΔH和ΔS分別為保留過(guò)程中溶質(zhì)的焓變和熵變，R為氣體常數(shù)，T為柱溫(K)，φ為相比，Δ(ΔH)和Δ(ΔS)分別為光學(xué)異構(gòu)體間的焓變和熵變的差值。以lnk'或lnα為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)作圖，得到Vant't Hoff曲線。芳樟醇對(duì)映體lnk'和lnα與1/T的相關(guān)性見(jiàn)表3。

表3 芳樟醇對(duì)映體lnk和lnα與1/T的相關(guān)性Table 3 Relationship between lnk and lnα of linalool and 1/T

由表3可以看出，芳樟醇對(duì)映體的lnk'和lnα與1/T之間具有較好的線性關(guān)系，這說(shuō)明在30～55℃范圍內(nèi)柱溫的變化對(duì)芳樟醇對(duì)映體在Chiral CD－Ph手性色譜柱保留機(jī)理影響較小。ΔH衡量溶質(zhì)在固定相上吸附過(guò)程的放熱情況，反映溶質(zhì)與固定相的作用力大小。ΔH值越負(fù)，說(shuō)明溶質(zhì)與固定相的作用越強(qiáng)，與固定相的結(jié)合在能量上更有利。ΔS表示溶質(zhì)吸附過(guò)程自由度的變化情況，ΔS越負(fù)說(shuō)明自由度降低越多，分子總體變得更有序。Δ(ΔH)表示兩對(duì)映體與固定相的作用強(qiáng)度之差，Δ(ΔS)表示自由度變化之差。若Δ(ΔH)和Δ(ΔS)均為負(fù)值，說(shuō)明手性拆分為焓驅(qū)動(dòng)，后出峰異構(gòu)體較前出峰異構(gòu)體與固定相存在較強(qiáng)的相互作用，溫度升高分離因子下降。若兩者皆為正值，說(shuō)明手性拆分為熵驅(qū)動(dòng)，分離因子和柱效均隨柱溫的升高而升高。若Δ(ΔH)為負(fù)而Δ(ΔS)為正，說(shuō)明兩者對(duì)手性識(shí)別均有貢獻(xiàn)［25－27］。

根據(jù)Vant't Hoff曲線可以求出芳樟醇對(duì)映體在CAPCELL PAK Chiral CD－Ph色譜柱保留過(guò)程中的焓變(ΔH)、焓變差(－Δ(ΔH))、熵變差(－Δ(ΔS))等熱力學(xué)參數(shù)。其中，焓變 ΔH分別為－5 844.08，－8 109.06 J/mol，焓變值均為負(fù)，說(shuō)明芳樟醇與β-環(huán)糊精固定相之間的作用較強(qiáng)，屬于放熱過(guò)程。而－Δ(ΔH)為負(fù)值(－2 370.24 J/mol)，－Δ(ΔS)為正值(6.60 J/mol)，這說(shuō)明芳樟醇對(duì)映體拆分過(guò)程中，既存在熵驅(qū)動(dòng)也存在焓驅(qū)動(dòng)，并以焓驅(qū)動(dòng)為主。

3 結(jié)論

本文采用超高效合相色譜對(duì)芳樟醇對(duì)映體進(jìn)行分離，考察了有機(jī)改性劑、柱溫、動(dòng)態(tài)背壓和進(jìn)樣量的影響，最終確定分離條件為:紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，改性劑為乙腈，流速為1.2 mL/min，柱溫30℃，動(dòng)態(tài)背壓1 700 psi，芳樟醇濃度為0.01%時(shí)，最佳進(jìn)樣量3 μL。最佳實(shí)驗(yàn)條件下的運(yùn)行時(shí)間僅為3 min，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)芳樟醇對(duì)映體的基線分離。并對(duì)超高效合相色譜分離芳樟醇對(duì)映體的熱力學(xué)進(jìn)行初步分析，為此類化合物的分離與分析提供了理論基礎(chǔ)。

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