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    LSECtin-CRD-GST融合蛋白的原核表達(dá)、純化及復(fù)性

    2015-11-29 08:31:44汪明群叢建波程莉董國福王少霞鄭文王長(zhǎng)振吳可
    生物技術(shù)通訊 2015年5期
    關(guān)鍵詞:融合

    汪明群 ,叢建波,程莉,董國福,王少霞,鄭文,王長(zhǎng)振,吳可

    1.宜賓市第一人民醫(yī)院,四川 宜賓 644000;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850

    C 型凝集素樹突細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子3結(jié)合非整合素分子(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN)家族成員肝臟免疫調(diào)控蛋白LSECtin(liver and lymph node sinusoidal endothelial cell Ctype lectin)是近年來克隆鑒定的新型凝集素蛋白,在肝臟和淋巴結(jié)表達(dá)[1-2],活體分離的外周血和胸腺樹突細(xì)胞(DC)及體外培養(yǎng)的活化巨噬細(xì)胞也有表達(dá)[3],并被證實(shí)是肝臟重要的免疫調(diào)控蛋白[4-5]。其基因與DC-SIGN、DC-SIGNR(DC-SIGN related protein)和CD23 的基因緊密排列于染色體19p13.3 區(qū)域。它們均屬于Ⅱ型C 型凝集素家族,具有相似的結(jié)構(gòu),由一個(gè)N 端的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)穿膜部分、一個(gè)含卷曲螺旋的頸部結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C 端糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domain,CRD)組成,其中CRD 結(jié)構(gòu)域是參與病毒感染及配體結(jié)合的主要功能結(jié)構(gòu)域[1,6]。近年來對(duì)LSECtin 分子的研究雖有較多進(jìn)展,但對(duì)其功能結(jié)構(gòu)域在溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在與配體相互作用時(shí)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化并未得到很好的闡明,這也是該領(lǐng)域研究中需要解決的重點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。

    我們擬采用基因克隆的方法構(gòu)建LSECtin-CRD的原核表達(dá)載體,并對(duì)其表達(dá)純化,旨在獲得足量可溶融合蛋白,為后續(xù)LSECtin-CRD 結(jié)構(gòu)域的功能與構(gòu)象變化研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    LSECtin-CRD 模板(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組與基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供);pGEX-6p-1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)標(biāo)所惠贈(zèng));大腸桿菌DH5α、Origami(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Novagen 公司);高保真DNA 聚合酶,DNA純化試劑盒,限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ(Promega公司);DL2000 DNA marker、λHindⅢ、T4DNA 連接酶(NEB 公司);蛋白質(zhì)分子量marker(Fermentas 公司);GST 抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)。

    1.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建

    根據(jù)LSECtin 基因序列和原核表達(dá)載體pGEX-6p-1 的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)上游引物P1(5'-CCGGAA TTCGGCTCCTGCTACTTTTT-3')和下游引物 P2(5'-CCCGCGGCCGCGCAGTTGTGGCCTTTTCT-3')。上、下游引物分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。用上述引物以LSECtin 為模板擴(kuò)增360 bp 的LSECtin-CRD 基因序列,目的片段純化、EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-6p-1 用T4DNA 連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,陽性克隆經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。

    1.3 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)

    將測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-LSECtin-CRD 轉(zhuǎn)化宿主菌Origami(DE3)進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。小量菌種培養(yǎng)過夜,1%接種量轉(zhuǎn)接后,D600nm為0.5~0.8 時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG,20℃低溫誘導(dǎo)6 h,離心收集菌體,用TBS 吹勻,洗3 次,離心后加TBST,超聲波破碎(超聲3 s 停2 s,共5 min,連續(xù)3 次后停5 min,重復(fù)操作5~8 次,直至溶液變得澄清),將得到的樣品(未誘導(dǎo)全菌為陰性對(duì)照)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)。

    1.4 包涵體的復(fù)性、純化及Western印跡鑒定

    將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于5000 r/min 離心10 min,棄上清,用TBS 洗2 次,收集菌體,按每克菌體加10 mL STET 緩沖液(pH8.0)的比例重懸,超聲波破菌后1000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀用10 mL包涵體洗滌液洗滌3 次,再用9 倍體積的含4 mol/L 尿素的TE 緩沖液(含20 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH8.0)洗滌,過夜,分別保留上清和沉淀,按10 mL/g 的比例用含8 mol/L 尿素的緩沖液(含0.2 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,pH8.0)溶解沉淀,4℃攪拌過夜,4℃低溫離心,上清即為目的蛋白。上述包涵體裂解液用含8 mol/L 尿素的緩沖液(含20 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH8.0)稀釋至0.2 mg/mL,加入DTT 至終濃度1 mmol/L,室溫放置4 h,用含4、3、2 mol/L 尿素的透析外液(含20 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,3 mmol/L GSH,0.5 mmol/L GSSG,pH8.0)進(jìn)行4℃梯度透析復(fù)性24 h,將復(fù)性的溶液進(jìn)行GST 柱親和純化,SDS-PAGE 檢測(cè)收集流出液,對(duì)純化的蛋白進(jìn)行Western印跡鑒定。

    對(duì)純化蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE;選用標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置,將蛋白移到PVDF 膜,設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300~400 mA,時(shí)間為60 min,為了避免發(fā)熱現(xiàn)象,將轉(zhuǎn)膜槽置于冰浴中;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,把PVDF 膜置入洗滌液漂洗2 min,去除洗滌液,加入含5%脫脂牛奶的TBST封閉液,在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60 min;用兔源單克隆抗體GST(1∶1000)孵育,4℃緩慢搖動(dòng)過夜,TBST 洗3 次,每次10 min;用羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,TBST 洗3次,每次10 min;ECL暗室曝光顯影。

    2 結(jié)果

    2.1 pGEX-6p-1-LSECtin-CRD原核表達(dá)載體的構(gòu)建

    用EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切膠回收擴(kuò)增的目的基因小片段,與同樣經(jīng)雙酶切的質(zhì)粒載體大片段連接后構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-6p-1-LSECtin-CRD,挑克隆擴(kuò)大培養(yǎng),酶切鑒定(圖1),顯示250~500 bp有特異的DNA 帶,大小與預(yù)計(jì)相符,初步表明目的片段已成功插入。對(duì)呈陽性結(jié)果的克隆保存菌種,取1.0 mL送Invitrogen 公司測(cè)序,結(jié)果表明基因序列正確匹配,被測(cè)片段包括了編碼LSECtin-CRD 的全部核苷酸序列及兩端的引物。

    2.2 LSECtin-CRD-GST融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

    將酶切鑒定及測(cè)序正確的pGEX-6p-1-LSECtin-CRD 轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami(DE3)宿主菌,外源基因表達(dá)后離心收集融合蛋白,SDS-PAGE 檢測(cè)表達(dá)情況,結(jié)果見圖2,在相對(duì)分子質(zhì)量約40×103處有蛋白表達(dá),與預(yù)計(jì)的融合蛋白大小吻合,表明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌后誘導(dǎo)出大量融合蛋白,但以包涵體形式存在,上清液里未發(fā)現(xiàn)可溶蛋白。

    2.3 包涵體的復(fù)性、純化及Western印跡鑒定

    對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌裂解及梯度透析復(fù)性處理后用GST柱親和純化,純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE(圖3)分析,結(jié)果顯示獲得純度高的目的蛋白。Western 印跡(圖4)檢測(cè)證明目的蛋白有特異的GST抗原性。

    圖1 pGEX-6p-1-LSECtin-CRD表達(dá)載體的雙酶切鑒定

    圖2 pGEX-6p-1-LSECtin-CRD在宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

    圖3 融合蛋白純化的SDS-PAGE分析

    圖4 Western印跡驗(yàn)證融合蛋白

    3 討論

    LSECtin 系肝臟及淋巴結(jié)竇內(nèi)皮細(xì)胞C 型凝集素,屬于疏水性強(qiáng)、富含二硫鍵的Ⅱ型跨膜糖蛋白。已有研究表明LSECtin-CRD在原核系統(tǒng)中以包涵體形式表達(dá)[5,7-8]。本實(shí)驗(yàn)中,我們選擇了有助于膜蛋白二硫鍵正確折疊的表達(dá)載體pGEX-6p-1。pGEX 質(zhì)粒載體將基因或基因片段與GST 融合后,不但能在細(xì)胞內(nèi)高水平誘導(dǎo)表達(dá),而且有助于提高表達(dá)蛋白的活性。我們還選擇大腸桿菌Origami(DE3)作為重組蛋白的宿主菌。Origami(DE3)是硫氧還蛋白還原酶(TrxB)突變的BL21 衍生菌,它能促進(jìn)重組蛋白在胞質(zhì)中形成二硫鍵,而普通的大腸桿菌不利于二硫鍵的形成,并且在同類衍生菌中,Origami(DE3)形成二硫鍵的活力是最強(qiáng)的[9]。有研究表明,在整體水平相當(dāng)?shù)那闆r下,采用Origami(DE3)宿主,曾使一個(gè)含二硫鍵的重組蛋白的表達(dá)活性提高了10 倍[10],同樣是包涵體,但用Origami(DE3)宿主菌更有利于翻譯后修飾,有效降低了重組蛋白的無序聚集,有益于下一步的復(fù)性。

    雖然我們?cè)诘蜏?、低IPTG 濃度、豐富培養(yǎng)基、短時(shí)誘導(dǎo)、錯(cuò)開目的蛋白等電點(diǎn)等方面進(jìn)行了摸索,依然沒能實(shí)現(xiàn)目的蛋白的可溶性表達(dá)。但本實(shí)驗(yàn)揭示宿主菌Origami 與表達(dá)載體pGEX-6p-1 是一對(duì)較佳的組合,這一組合有效地提高了表達(dá)蛋白的活性,降低了重組蛋白的無序折疊,易化了后續(xù)復(fù)性工作,對(duì)表達(dá)融合蛋白具有重要的借鑒意義。

    [1]Liu W,Tang L,Zhang G,et al.Characterization of a novel C-type lectin-like gene,LSECtin:demonstration of carbohydrate binding and expression in sinusoidal endothelial cells of liver and lymph node[J].J Biol Chem,2004,279:18748-18758.

    [2]Domínguez-Soto A,Aragoneses-Fenoll L,Gómez-Aguado F,et al.The pathogen receptor liver and lymph node sinusoidal endotelial cell C-type lectin is expressed in human Kupffer cells and regulated by PU.1[J].Hepatology,2009,49(1):287-296.

    [3]Domínguez-Soto A,Aragoneses-Fenoll L,Martin-Gayo E,et al.The DC-SIGN-related lectin LSECtin mediates antigen capture and pathogen binding by human myeloid cells[J].Blood,2007,109(12):5337-5345.

    [4]Tang L,Yang J,Liu W,et al.Liver sinusoidal endothelial cell lectin,LSECtin,negatively regulates hepatic T-cell immune response[J].Gastroenterology,2009,137(4):1498-1508.

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