非阿片類(lèi)藥物KOR激動(dòng)劑Salvinorin A減輕前腦缺血再灌注大鼠腦水腫的作用

張 燕 王震虹 何振洲 忻紀(jì)華

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院南院麻醉科，上海 201112

非阿片類(lèi)藥物KOR激動(dòng)劑Salvinorin A減輕前腦缺血再灌注大鼠腦水腫的作用

張 燕 王震虹 何振洲 忻紀(jì)華▲

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院南院麻醉科，上海 201112

目的 探討大鼠前腦缺血再灌注（I/R）損傷后，Kappa阿片受體（KOR）激動(dòng)劑Salvinorin A（SA）減輕腦水腫的機(jī)制。方法 成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為5組（n=10）：假手術(shù)組、I/R組、DMSO（SA溶劑）組、SA組和Norbinaltorphimine（nor-BIN，KOR拮抗劑）+SA組。夾閉雙側(cè)頸動(dòng)脈聯(lián)合低血壓誘發(fā)前腦缺血10 min，在缺血后即刻給予DMSO、SA和nor-BIN+SA。再灌注后24 h處死大鼠，取其海馬組織做病理，采用末端轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）及免疫組織化學(xué)檢測(cè)AQP4蛋白水平，用干-濕重法評(píng)估腦含水量。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，I/R組海馬腦含水量增加（P＜0.01）；SA組和I/R組相比，海馬腦含水量顯著下降（P＜0.01）；nor-BIN+ SA組腦含水量顯著高于SA組（P＜0.05）。前腦缺血再灌注后24 h，與I/R和DMSO組比較，SA組顯著減少海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡（P＜0.01），而nor-BIN可抵消這一作用。與假手術(shù)組比較，海馬的AQP4蛋白水平，在I/R組顯著增加（P＜0.01）；與I/R組比較，SA組顯著下降（P＜0.01）；nor-BIN+SA組AQP4的蛋白水平和SA組相比明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論SA可以明顯減輕前腦缺血后的腦水腫，減輕腦損傷，抑制AQP4的蛋白水平，其作用可能和KOR相關(guān)。

腦缺血再灌注；腦水腫；腦損傷；κ阿片受體激動(dòng)劑；水通道蛋白4

腦卒中是繼癌癥和心臟疾病后導(dǎo)致患者殘疾和死亡的主要原因[1]。腦缺血后腦水腫主要威脅腦卒中患者，但目前對(duì)降低人腦卒中后腦水腫的可行性研究很少[2]。許多研究都以降低腦梗死體積和神經(jīng)元細(xì)胞死亡作為首要目標(biāo)，而不是減輕腦水腫?，F(xiàn)今，鑒于腦水腫與腦損傷密切相關(guān)，人們?cè)絹?lái)越多地關(guān)注腦水腫。

水通道蛋白（AQP）是一種選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的蛋白質(zhì)家族，其中主要的亞型AQP4在中央系統(tǒng)里很豐富，在水分子運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-4]。許多證據(jù)表明，腦缺血再灌注中，AQP4的調(diào)控與腦水腫的發(fā)展相關(guān)[5]。有研究表明，在腦缺血損傷后，AQP4的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促使腦水腫及腦損傷加重[6]。一些專(zhuān)家已證實(shí)，抑制AQP4能顯著減輕缺血性腦水腫[7]。研究觀察到在腦水腫造成腦損傷后24～72 h，海馬AQP4表達(dá)水平達(dá)峰值[6]，7 d后恢復(fù)正常。因此，腦缺血后AQP4的調(diào)控是用于治療腦水腫的靶點(diǎn)。

Kappa阿片受體（KOR）在細(xì)胞和動(dòng)物模型中均證實(shí)具有腦神經(jīng)保護(hù)作用[8]。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，KOR激動(dòng)劑還可以減輕前腦缺血后的腦水腫[1]。Salvinorin A（SA）是迄今為止最有效的唯一天然來(lái)源的高選擇性的非阿片類(lèi)藥物KOR激動(dòng)劑[9]。已有研究證實(shí)SA能保護(hù)缺血再灌注后腦自動(dòng)調(diào)節(jié)[10]，而此功能和腦水腫的形成相關(guān)?；谝陨献C據(jù)，筆者推測(cè)SA激動(dòng)KOR，通過(guò)抑制AQP4的表達(dá)來(lái)減輕腦缺血再灌注后的腦水腫，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，體重250～300 g，將其分為5組，每組10只。假手術(shù)組：僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和一側(cè)股動(dòng)脈，不進(jìn)行缺血造模；前腦缺血（I/R）組：缺血造模；SA溶劑（DMSO）組：在缺血后立即給予0.1 mL/100 g DMSO；SA組：前腦缺血后靜脈注射SA 10 μg/kg；KOR拮抗劑（nor-BIN）+SA組：缺血后即刻靜注SA 10 μg/kg后聯(lián)合給予nor-BIN 2 mg/kg。

1.2 主要試劑與儀器

SA（Sigma，USA）、DMSO（Amereso，USA）、nor-BIN（Sigma，USA）、TOPO型大鼠呼吸機(jī) （Kent Scientific Co.，美國(guó)）、圖像分析系統(tǒng)（ZEISS，德國(guó)）、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（ROCHE，瑞士）、4%多聚甲醛溶液（上海華美生物技術(shù)有限公司）。

1.3 前腦I/R模型制作

采用經(jīng)典BCCAO模型[11]。10%水合氯醛（40 mg/ 100 g）經(jīng)腹腔注射給藥麻醉大鼠后氣管插管，經(jīng)頸部解剖分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并游離股動(dòng)脈插管，從股動(dòng)脈抽血6～10 mL，使大鼠平均動(dòng)脈壓維持在25～30 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈誘發(fā)前腦缺血維持10 min。

1.4 標(biāo)本取材

缺血24 h，每組大鼠取5只采用4%多聚甲醛由心臟灌注后保存用以病理、末端轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）檢測(cè)以及免疫組化測(cè)定，另5只取腦組織后稱(chēng)重用以測(cè)定腦水含量。

1.5 腦水含量測(cè)定

前腦缺血后24 h取大腦，用中性濾紙吸收和除去大腦中的血漬。在90 s離析的化學(xué)平衡（CP-413，OHAUS USA）中測(cè)定每個(gè)大腦右半球的濕重，將大腦置于110℃恒溫烘箱中烘烤24 h，得到干重。采用干濕法測(cè)腦組織中水含量，腦組織含水量=[（濕重-干重）/濕重]×100%。

1.6 TUNEL檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明操作。選取4個(gè)不同區(qū)域顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像處理、分析，計(jì)算各組大鼠海馬組織CA1區(qū)腦缺血后24 h凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性率。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率=（TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.7 病理學(xué)檢查

腦缺血24 h后采用4%多聚甲醛灌注固定標(biāo)本，包埋切片后蘇木精-伊紅（HE）染色，選取固定區(qū)域顯微鏡下觀察腦神經(jīng)細(xì)胞損傷情況，計(jì)數(shù)壞死細(xì)胞比例。

1.8 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

前腦缺血后24 h，由左心室灌注4%多聚甲醛溶液固定腦組織，觀察海馬CA1區(qū)AQP4蛋白相對(duì)表達(dá)量。采用免疫組化SP法，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗和二抗孵育后，顯色，脫水，封片，顯微鏡下觀察。AQP4表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)顯示棕黃色顆粒。每個(gè)切片選取不同的4個(gè)視野，觀察并拍照，采用Image-pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)讀取視野積分光密度值（IOD）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦含水量比較

統(tǒng)計(jì)分析顯示：假手術(shù)組、I/R組、DMSO組、SA組和nor-BIN+SA組腦含水量分別為（62.14±0.83）%、（65.14±0.40）%、（64.28±0.37）%、（61.42±0.23）%和（64.36±0.39）%。與假手術(shù)組比較，I/R組海馬腦含水量顯著增高（P＜0.01）；與I/R組比較，SA組的腦含水量顯著降低（P＜0.01）；nor-BIN+SA組腦含水量顯著高于SA組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腦含水量比較（n=5）

2.2 各組大鼠病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠海馬CA1區(qū)遭受破壞，DMSO組也出現(xiàn)神經(jīng)元損傷。統(tǒng)計(jì)分析顯示，假手術(shù)組、I/R組、DMSO組、SA組和nor-BIN+SA組壞死神經(jīng)細(xì)胞百分比分別為：（9.72±0.96）%、（65.16± 3.07）%、（69.42±6.26）%、（30.35±3.19）%和（53.32± 5.76）%。與I/R組比較，SA組腦損傷顯著減輕 （P＜0.01）；與SA組比較，nor-BIN+SA組腦損傷加重（P＜0.05），與I/R組接近。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果（HE，400×）

2.3 各組凋亡情況比較

統(tǒng)計(jì)分析顯示，假手術(shù)組、I/R組、DMSO組、SA組和nor-BIN+SA組凋亡細(xì)胞指數(shù)分別為（8.75±1.13）%、（51.56±3.86）%、（51.98±3.83）%、（19.91±1.87）%和（31.19±1.95）%。假手術(shù)組大鼠腦組織中幾乎無(wú)凋亡細(xì)胞，在I/R組和DMSO組中檢測(cè)到的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與I/R組比較，SA組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少（P＜0.01）；與SA組比較，nor-BIN+SA組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多（P＜0.01）。見(jiàn)圖3（封三）。

2.4 各組大鼠AQP4蛋白表達(dá)情況比較

統(tǒng)計(jì)分析顯示，假手術(shù)組、I/R組與DMSO組海馬CA1區(qū)AQP4表達(dá)的IOD值分別為：（211.7±16.7）、（1799.0±179.2）和（1475.0±162.0）；海馬AQP4蛋白在假手術(shù)組腦組織切片中幾乎沒(méi)有觀察到AQP4陽(yáng)性細(xì)胞，而在I/R組AQP4表達(dá)增加（P＜0.01）。與I/R組比較，SA組AQP4表達(dá)顯著減少（P＜0.01），SA組與SA+nor-BIN組海馬CA1區(qū)AQP4表達(dá)的IOD值分別為（584.2±40.0）和（925.1±55.9），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SA抑制海馬AQP4表達(dá)，而nor-BIN則可抵消這一作用。見(jiàn)圖4（封三）。

3 討論

3.1 大腦缺血再灌注問(wèn)題和KOR激動(dòng)劑的潛在作用

腦I/R較易出現(xiàn)在圍術(shù)期，尤其是體外循環(huán)、器官移植等大手術(shù)后更易發(fā)生腦I/R。腦水腫通常發(fā)生在缺血后3 h，而在缺血后48 h達(dá)到高峰[12]。腦水腫可使顱內(nèi)壓增高，壓迫周?chē)M織，減少梗死或邊緣區(qū)域的血流，加重腦損害[13]。截至目前，還是缺乏有效的方法來(lái)阻止腦水腫，但神經(jīng)保護(hù)是一個(gè)良好的研究治療方向。在缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，已證實(shí)KOR激動(dòng)劑的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[14]。在離體[1]和在體[2]實(shí)驗(yàn)研究中均證實(shí)，KOR激動(dòng)劑可以減輕腦缺血后腦水腫及繼發(fā)引起的腦損傷，并且其作用是通過(guò)KOR介導(dǎo)的。

3.2 SA——治療腦水腫的新型藥物

雖然KOR激動(dòng)劑在臨床上有巨大的治療價(jià)值，但因其低選擇性限制了現(xiàn)有的KOR激動(dòng)劑在實(shí)踐中更廣泛的應(yīng)用。SA具有多種優(yōu)勢(shì)：從一種盛產(chǎn)的植物中同步提取并分離純化和制備；易合成，起效迅速，作用短暫；類(lèi)脂溶性，容易通過(guò)血腦屏障；兼有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛雙重作用；大劑量長(zhǎng)期使用時(shí)，仍對(duì)重要臟器無(wú)明顯損害作用；無(wú)呼吸抑制，沒(méi)有直接致幻或躁動(dòng)等不良反應(yīng)[15]。本課題組通過(guò)前期的研究工作已經(jīng)證實(shí)，在腦缺血前和缺血后 （即刻、30 min和1 h）靜注SA均可保留軟腦膜動(dòng)脈的自動(dòng)調(diào)節(jié)功能，在高碳酸血癥和低血壓時(shí)，保持腦動(dòng)脈的血管擴(kuò)張作用[16]。結(jié)果提示，在大鼠海馬中給予SA能明顯減輕腦水腫，挽救壞死凋亡的神經(jīng)元，進(jìn)而避免腦組織缺血再灌注損傷。

3.3 AQP4的作用

近年來(lái)，AQP4參與腦水腫的形成越來(lái)越受到關(guān)注，成為腦水腫的治療靶點(diǎn)[17]。AQP4主要表達(dá)于毛細(xì)血管周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞足突和室管膜細(xì)胞，尤其在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)豐富。之前的研究已經(jīng)表明，短暫性腦缺血再灌注增加AQP4的表達(dá)，導(dǎo)致腦水腫[17]。在本研究中，腦缺血后24 h腦水腫明顯，海馬中AQP4蛋白水平也同時(shí)明顯增加。雖然已證明，KOR激動(dòng)劑可以減輕腦水腫，但很少有研究者關(guān)注這一作用與AQP4的關(guān)系。本研究觀察到缺血后給予SA，腦水腫程度明顯減輕，海馬CA1中AQP4蛋白水平減少。結(jié)果表明，SA抑制AQP4表達(dá)，同時(shí)減輕腦水腫和前腦缺血后的腦細(xì)胞凋亡和壞死。因此，SA減輕腦水腫的作用與抑制腦組織AQP4表達(dá)有關(guān)。此外nor-BIN能抵消SA的作用，這表明SA的保護(hù)作用可能是通過(guò)KOR介導(dǎo)的。

本研究有3個(gè)新的發(fā)現(xiàn)：首先，前腦缺血再灌注后即刻給予SA能減輕缺血后腦水腫和腦損傷；其次，SA能抑制海馬CA1上的AQP4表達(dá)；第三，KOR拮抗劑nor-BIN可抵消SA的治療作用，SA的部分作用是通過(guò)KOR實(shí)現(xiàn)的。

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The non-oPioid KOR agonist Salovinorin A reducing brain edema in rats with forebrain ischemia and rePerfusion

ZHANG Yan WANG Zhenhong HE Zhenzhou XIN Jihua▲
Department of Anesthesiology,South Hospital of Renji Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai201112,China

Objective To discuss the mechanism of Kappa opioid receptor(KOR)agonist Salvinorin A(SA)on decreasing brain edema after forebrain ischemia-reperfusion (I/R)injury in rats.Methods Male Sprague-Dawley rats were divided into 5 groups(n=10):sham operation group,I/R group,DMSO(vehicle)group,SA group and Norbinaltorphimine (nor-BIN,KOR antagonist)+SA group.Forebrain ischemia was performed by low artery pressure with bilateral carotid artery occlusion for 10 minutes.Intervenes(DMSO,SA,nor-BIN+SA)were performed after forebrain ischemia instantly. The animals were sacrificed 24 hours after reperfusion.The hippocampus was taken for pathology,and TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)and immunohistochemical test were used for AQP4 detection.The wet-dry weight method was used to assess brain water content.Results Compared with sham operation group,hippocampus water content increased in I/R group(P＜0.01).Hippocampus water content was significantly lower in SA group than that in I/R group(P＜0.01).Hippocampus water content was significantly higher in nor-BIN+SA group than that in SA group(P＜0.05).Compared with I/R and DMSO groups,hippocampus neurosis and apoptosis were alleviated significantly with treatment of SA 24 h after forebrain I/R (P＜0.01),which effect was blunted by nor-BIN.Compared with sham operation group,AQP4 expressed in hippocampus was promoted by I/R (P＜0.01).Compared with I/R group,AQP4 expressed was depressed in SA group (P＜0.01).The expression of AQP4 increased significantly with treatment of nor-BIN+SA compared with SA (P＜0.05).Conclusion SA can reduce cerebral edema after forebrain ischemia and brain damage by inhibition of AQP4.Its mechanism may be correlated with KOR.

Cerebral ischemia reperfusion;Cerebral edema;Cerebrum damage;Kappa opioid agonist;AQP4

R743.3

A

1673-7210（2015）11（a）-0004-05

2015-07-27本文編輯：程 銘）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81300996）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目（12XJ10054）。

▲通訊作者