小黑藥總黃酮抗氧化性研究

楊濤++韓磊++馮國強++宋培培++劉品華

摘要 研究小黑藥全株總黃酮的含量及提取分離，并用Schaal烘箱法、紫外光照法測試了小黑藥總黃酮和對照品BHT抗豬油氧化的能力，采用POV抑制率評價了抗氧化能力。測試了總黃酮和蘆丁的還原能力、抑制超氧陰離子自由基（O2-·）的能力、DPPH自由基的清除能力、羥基自由基的清除能力。結果表明：小黑藥總黃酮有良好的抗豬油氧化的作用，其抗光氧化的效果高于自動氧化；還原能力、抑制超氧陰離子自由基（O2-·）的能力、DPPH自由基的清除能力略低于蘆丁，羥基自由基的清除能力高于蘆??；小黑藥全株總黃酮含量為2.52%。

關鍵詞 小黑藥；總黃酮；抗氧化性；過氧化值

中圖分類號 TS202.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）17-0311-03

Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Sanicula astrantiifolia Wolff

YANG Tao HAN Lei FENG Guo-qiang SONG Pei-pei LIU Pin-hua*

（College of Chemistry and Chemical Engineering，Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011）

Abstract In this paper，the content and the optimum extraction of total flavonoid from Sanicula astrantiifolia Wolff were studied.The antioxidant activity of total flavonoids and the reference substance BHT were detected by Schaal Oven Method and UV photo-induced，and the antioxidant activity was estimated by inhibition ratio of POV.The reduction capacity of total flavonoids and Rutin，the inhibition ratio of total flavonoids to superoxide free radical（O2-·），its DPPH and hydroxyl free radicals-cavenging effect were determined.The results showed that：The total flavonoids from Sanicula astrantiifolia Wolff showed significant inhibitory effects on the oxidation of lard oil，its antioxidant effect was greater than automatic oxidation.The reduction capacity，the inhibition ratio to superoxide free radical（O2-·），its DPPH free radicals-cavenging effect were slightly lower than Rutin，and its hydroxyl free radicals-cavenging effect was greater than Rutin.The content of total flavonoid from Sanicula astrantiifolia Wolff was 2.52%.

Key words Sanicula astrantiifolia Wolff；total flavonoids；antioxidant activity；peroxide value

小黑藥（Sanicula astrantiifolia Wolff）具有補肺益腎、治療肺結核、腎虛腰痛、頭昏等功效[1]。云南民間常食用小黑藥，以提高免疫力和鎮(zhèn)痛、止咳等[2]?，F(xiàn)代食品工業(yè)中也通過小黑藥改善產(chǎn)品質(zhì)量，提高營養(yǎng)價值，在油脂及相關產(chǎn)業(yè)中得到積極應用[3-5]。筆者研究了小黑藥中的總黃酮含量、抗豬油氧化效果及抗氧化性能，旨在探索小黑藥中的活性成分及功能，為深入開發(fā)和利用小黑藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。小黑藥（曲靖農(nóng)貿(mào)市場購買）；豬油（曲靖農(nóng)貿(mào)市場購買新鮮豬肥膘，實驗室火煉法提取）；蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z定所）；Tris（北京西美杰科技有限公司）；1，1-二苯-2-苦基肼（日本和光純樂工業(yè)株式會社）；二丁基羥基甲苯（BHT）（鄭州超凡有限公司）；氯化亞鐵（天津市風船化學試劑科技有限公司）；硫氰酸鉀（天津市風船化學試劑科技有限公司）；鄰苯三酚（AR）；硫酸亞鐵（AR，廣東臺山化工廠）；水楊酸（AR，天津市化學試劑工廠）等。試劑均為分析純。

1.1.2 儀器。紫外可見分光光度計（TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司）；XPA系列光化學反應儀（南京胥江機電廠）；恒溫培養(yǎng)箱（29SN-DP-501，天津?qū)嶒瀮x器廠）；電子天平（AL204-IC型，梅特勒-托利多儀器上海有限責任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AAA型，上海伊利儀器制造有限公司）；萬能高速粉碎機（DFY-800C型，溫嶺市林大機器有限公司）；電熱鼓風恒溫干燥箱（型號：DHG-9075A，上海齊欣科學儀器有限公司）；離心機（低速離心機，常州國華電器有限公司）。

1.2 試驗方法endprint

1.2.1 小黑藥總黃酮的提取。小黑藥全株干粉用75%乙醇回流提取4次，每次提取時間為3 h，將回流提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮，用石油醚萃取濃縮液3次除去大量的葉綠素、蠟等物質(zhì)。下層進一步濃縮制樣，用硅膠層析柱分離，先用石油醚∶乙酸乙酯=6∶4（v/v）洗脫除盡葉綠素，然后用75%乙醇洗脫黃酮，用減壓濃縮回收乙醇。濃縮液加入1%堿式醋酸鉛，使黃酮類物質(zhì)沉淀，用離心機分離沉淀，沉淀用無水乙醇分散后用10%硫酸調(diào)pH值為1～2，溫熱分解，抽濾得到清液，清液用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH值為6～7，再減壓濃縮后用聚酰胺柱層析法進行分離，先用蒸餾水洗脫，再用無水乙醇洗脫，將無水乙醇洗脫物旋干后用無水乙醇溶解離心清液即為小黑藥待測總黃酮溶液。

1.2.2 最大波長的確定。于10 mL容量瓶中加入質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL蘆丁標準溶液2.00 mL、5%亞硝酸鈉0.6 mL、無水乙醇3.0 mL，搖勻后放置6 min，然后加入10%硝酸鋁溶液0.6 mL，搖勻后放置6 min，再加入8.6%氫氧化鈉3.0 mL，并用50%乙醇定溶至刻度。在400.00～600.00 nm的范圍掃描，最大吸收處為508 nm。

1.2.3 標準曲線的建立。在10 mL容量瓶中，分別加入0.336 0 mg/mL蘆丁標準溶液（質(zhì)量濃度）0、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10 mL，按1.2.2方法顯色，在508.00 nm處測定吸光度，得標準曲線回歸方程如下：

y=0.008 2x+0.002 7，R2=0.999 4

1.2.4 小黑藥待測總黃酮含量的測定。小黑藥待測總黃酮溶液1.00 mL置10 mL容量瓶中用無水乙醇定容至刻度，在10 mL容量瓶中加入稀釋后的總黃酮溶液0.30 mL，按1.2.2方法顯色，并測定508 nm吸光度，由標準曲線回歸方程得出樣液總黃酮含量相當于蘆丁的含量為28.386 1 mg/mL?？紤]到試驗與蘆丁的對比，把待測總黃酮溶液稀釋到濃度0.336 0 mg/mL得總黃酮測試液。

1.2.5 回收率試驗。于10 mL容量瓶中加入小黑藥待測總黃酮溶液0.25 mL、0.336 0 mg/mL蘆丁溶液2.00 mL；于10 mL容量瓶中加入小黑藥待測總黃酮溶液0.25mL；取0.336 0 mg/mL蘆丁對照品溶液2.00 mL。3個處理均按1.2.2方法顯色，并在508 nm處測定吸光度，分別由回歸方程計算得黃酮含量為A、B、C。計算得到總黃酮回收率為96.24%。公式如下：

回收率（%）=■×100

1.2.6 小黑藥全株總黃酮含量的測定。準確稱取小黑藥全株干粉2.000 9 g，用75%乙醇提取4次，每次提取時間為3 h，將回流提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后制樣，用硅膠層析柱分離，先用石油醚∶乙酸乙酯=6∶4（v/v）洗脫除去葉綠素，然后用75%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮制樣，再過聚酰胺柱，先用蒸餾水洗脫，再用無水乙醇洗脫，乙醇洗脫液減壓除去溶劑，用無水乙醇定容于25 mL容量瓶中，從中取0.30 mL溶液于10 mL容量瓶中，按1.2.2方法顯色，在508 nm處測吸光度，由標準曲線回歸方程計算總黃酮。

1.2.7 過氧化值的測定。按照GB/T5009.37中方法配制鐵標準儲備溶液和使用溶液等，然后用分光光度計按標準中的方法檢測繪制標準曲線。油樣過氧化值檢測按照GB/T5009.37中比色法檢測?；貧w方程如下：

y=0.027 3x-0.011 3，R2=0.999 0

1.2.8 光照誘導氧化法。分別取3支50 mL比色管，加入50.000 0 g豬油。第一管加入0.010 0 g小黑藥總黃酮，第二管加入0.010 0 g二丁基羥基甲苯（BHT），第三管作為空白對照。放入光化學反應儀，于室溫條件下用100 W紫外燈照射，每隔30 min分別取樣0.500 0 g于10 mL容量瓶中，按GB/T5009.37中比色法檢測，每組平行做3次。

1.2.9 烘箱誘導氧化法。分別取3支50 mL比色管，加入50.000 0 g豬油。第一管中加入0.010 0 g小黑藥總黃酮，第二管加入0.010 0 g二丁基羥基甲苯（BHT），第三管作為空白對照。將上述3支比色管置于60 ℃恒溫箱內(nèi)，每48 h分別取樣0.500 0 g于10 mL容量瓶，按GB/T5009.37中比色法檢測，每組平行做3次。

1.2.10 評價方法。按文獻[2，6]中相對防效值和Pb值的計算方法做適當修改，按下列公式計算POV抑制率（%），POV抑制率越大說明抗氧化效果越好。POV抑制率下降越小說明抗氧化持續(xù)時間能力就越大。

抑制率（POV）（%）=■×100

1.2.11 還原能力的測定。分別取總黃酮測試液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，于25 mL的比色管中，并補充水至0.50 mL（即得質(zhì)量濃度為67.20、134.40、201.60、268.80、336.00 μg/mL總黃酮溶液），采用不加鐵氰化鉀的為對應空白樣（共6份）。分別加入0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH=6.6）2.50 mL和1%鐵氰化鉀2.50 mL混合均勻，于50 ℃水浴中反應20 min后快速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL，混合均勻（澄清無需離心）。取清液2.50 mL于試管中，加入蒸餾水2.50 mL，再加入0.1%三氯化鐵溶液0.50 mL，混合均勻，于室溫下靜置反應10 min，1 cm石英比色皿在700 nm處測定吸光度值。質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL的對照樣蘆丁其還原能力測定方法同上。

1.2.12 抑制O2-·試驗。分別取總黃酮測試液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，于25 mL比色管中，補充水至5 mL。各加入pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.70 mL、3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.30 mL（試驗樣液測試時濃度分別為3.36、6.72、10.08、13.44、16.80、20.16 μg/mL），用純水作空白，測試溫度13 ℃（測試液體溫度），用1 cm石英比色皿在320.00 nm波長下測試，吸光值為Ax，以10 mmol/L鹽酸緩沖溶液0.30 mL代替鄰苯三酚溶液測定的吸光值為Axo。用純水代替試驗樣液（加水5 mL）測得的吸光值為Ao，用純水代替試驗樣液和鄰苯三酚（加水5.3 mL）測得的吸光值為Aox。質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL的對照樣蘆丁，試驗方法同上。試樣對超氧陰離子自由基的抑制率為：endprint

抑制率（%）=（1-■）×100

1.2.13 清除DPPH試驗。于250 mL容量瓶中，加入稱取的DPPH 20 mg，并用無水乙醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度2×10-4 mol/L的DPPH溶液，于0～4 ℃下避光保存。分別取總黃酮測試液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于25 mL比色管中，補充乙醇至2.00 mL，然后加入配制好的DPPH溶液2.00 mL混勻（試驗樣液質(zhì)量濃度為8.40、16.80、25.20、33.60、42.00、50.40 μg/mL），于室溫暗處放置反應30 min，在517 nm下測得的吸光值為A1，以2.00 mL乙醇代替樣液所測得的吸光值為A2，以2.00 mL乙醇代替DPPH溶液測得的吸光值為A3（空白）；質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL的對照樣蘆丁，試驗方法同上。試樣對DPPH的清除率為：

清除率（%）=（1-■）×100

1.2.14 清除·OH試驗。分別取總黃酮測試液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，于25 mL的容量瓶中，各加入6 mmol/L硫酸亞鐵2.00 mL、6 mmol/L過氧化氫2.00 mL，放置25 min后，用6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液定容至25 mL（即樣液測試質(zhì)量濃度為1.34、2.69、4.03、5.38、6.72、8.06 μg/mL）。在36～37 ℃恒溫水浴中反應15 min，1 cm石英比色皿于510 nm處測定吸光度值Ax，以乙醇代替試驗樣液測得吸光度值為Ao（空白管乙醇），以乙醇代替水楊酸-乙醇組測得吸光度值Axo（空白管），以乙醇代替試驗樣液、水楊酸-乙醇的為空白管。質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL的對照樣蘆丁，方法同上。試樣對羥基自由基的清除率為：

清除率（%）=（1-■）×100

2 結果與分析

小黑藥全株總黃酮含量見表1。表2、表3說明小黑藥總黃酮對油脂的光誘導氧化和自動氧化都有抗氧化的效果。光誘導氧化、烘箱法誘導氧化的POV抑制率平均值分別為24.56、8.72%，說明總黃酮對抗光引發(fā)油脂的抗氧化效果高于自動氧化的效果。POV抑制率下降的趨勢說明總黃酮抗油脂自動氧化的持續(xù)能力優(yōu)于光引發(fā)氧化的能力。與抗氧化劑BHT的POV抑制率對比表明在同樣使用量的情況下總黃酮的效果不如BHT。但從食用安全性角度考慮總黃酮具有較大的優(yōu)勢，如果增加總黃酮的量也會有較好的抗油脂氧化的效果。

抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基，還原能力越強，抗氧化性越強[7]。通過測定還原能力可說明抗氧化性的大小[8]。表4說明小黑藥總黃酮表現(xiàn)出較好的還原能力，隨著試樣質(zhì)量濃度的增加，還原能力逐漸增強，但效果略低于蘆丁。

超氧陰離子自由基的形成最早，是氧進行單電子的還原反應首先生成的產(chǎn)物。由它可生成羥自由基（·OH）、過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物（ROOH）及單線態(tài)氧等其他活性氧，引發(fā)人體許多疾病的生理變化[9]。表5數(shù)據(jù)說明隨總黃酮和蘆丁質(zhì)量濃度增大抑制效果提高，在低濃度時總黃酮的效果略高于蘆丁，高濃度時略低于蘆丁，對O2-·抑制效果隨時間的延長逐漸下降，且趨勢基本一致。

N，N-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在517 nm 波長處有強吸收（深紫色）。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子數(shù)配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子成定量關系，所以可以較迅速地評價物質(zhì)的抗氧化能力[4]。由表6可知，小黑藥總黃酮和蘆丁對DPPH自由基的清除能力很強，總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大逐漸提高，質(zhì)量濃度大于33.60 μg/mL后清除能力趨于穩(wěn)定，雖然蘆丁對DPPH自由基的清除能力略優(yōu)于總黃酮，但總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大，其清除率增加值優(yōu)于蘆丁。

羥自由基是目前所知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，它可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、

蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷，使細胞壞死或突變。由表7可知，總黃酮對羥基自由基的清除能力在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)優(yōu)于蘆丁，且清除率隨質(zhì)量濃度的提高清除能力趨勢與蘆丁基本一致。

3 結論

研究結果表明，小黑藥全株總黃酮含量為2.52%，抗豬油光氧化的效果高于自動氧化的效果，對于油脂產(chǎn)品在貨架期的保質(zhì)是有利的。表現(xiàn)出較好的還原能力、抑制率超氧陰離子自由基能力、清除DPPH自由基和羥基自由基的能力，在食用和保健方面都有較好的開發(fā)利用價值。

4 參考文獻

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