乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性對(duì)免疫抑制狀態(tài)下小鼠肝癌復(fù)發(fā)的影響

高偉，葛亮（.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 3009； .天津市兒童醫(yī)院，天津 300074）

供體缺乏已成為制約肝移植發(fā)展的主要瓶頸。邊緣供肝的使用是目前擴(kuò)大供體來(lái)源的主要方式之一。目前國(guó)內(nèi)外均有應(yīng)用乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽(yáng)性供肝行肝移植術(shù)的研究報(bào)道，證實(shí)了HBsAg陽(yáng)性供肝的安全性［1-3］。本中心曾嘗試應(yīng)用HBsAg陽(yáng)性供肝治療晚期肝癌患者，但術(shù)后隨訪患者均死于肝癌復(fù)發(fā)，因此HBsAg陽(yáng)性供肝是否會(huì)促進(jìn)肝癌患者腫瘤復(fù)發(fā)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)建立乙型肝炎病毒（HBV）轉(zhuǎn)基因小鼠移植性肝癌模型，對(duì)其進(jìn)行免疫抑制藥物干預(yù)，比較免疫抑制狀態(tài)下血清學(xué)HBsAg陽(yáng)性與陰性小鼠肝臟腫瘤的復(fù)發(fā)及進(jìn)展，為臨床應(yīng)用HBsAg陽(yáng)性供肝進(jìn)行肝移植治療以挽救晚期肝癌患者的可行性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Balb/c雄性小鼠30只，8～10周齡，體重18～22 g，購(gòu)于天津市奧易德實(shí)驗(yàn)用品有限公司。HBV轉(zhuǎn)基因Balb/c雄性小鼠30只，8～10周齡，體重18～22 g，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍第四五八醫(yī)院。

1.1.2 主要試劑：小鼠肝癌H22腹腔積液型腫瘤細(xì)胞株（購(gòu)于北京銀紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），甲潑尼龍琥珀酸鈉（購(gòu)于美國(guó)輝瑞公司），環(huán)孢素A（購(gòu)于瑞士諾華制藥公司），增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體（購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抗體（購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司），細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）抗體（購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：30只雄性HBV轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)組，30只普通雄性Balb/c小鼠為對(duì)照組，分別于術(shù)后1、2、3周處死小鼠，每組每次為10只。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞的制備：從液氮中取出凍存的小鼠H22肝癌細(xì)胞株，常規(guī)復(fù)蘇，用生理鹽水調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，無(wú)菌條件下用1ml BD注射器直接注入Balb/c小鼠腹腔0.1 ml（細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)）。小鼠接種H22肝癌細(xì)胞9天后無(wú)菌抽取癌性腹腔積液，錐蟲(chóng)藍(lán)染色，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞存活率＞95%，常規(guī)計(jì)數(shù)細(xì)胞，生理鹽水調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 手術(shù)過(guò)程：稱(chēng)量小鼠體重，用5%水合氯醛（5 ml/kg）進(jìn)行腹腔麻醉。麻醉滿(mǎn)意后，以仰臥位用膠帶將其固定于手術(shù)臺(tái)上，切口周?chē)鷤淦ぃ⒁园矤柕庀?。于腹正中線偏左作一長(zhǎng)約0.8 cm左右的縱形切口，無(wú)菌棉棒充分暴露脾臟，用1 ml BD注射器于小鼠脾包膜下注入已制備好H22肝癌細(xì)胞株0.05 ml，細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，緩慢退出針頭，并在針眼處用無(wú)菌棉棒壓迫5～10分鐘，防止出血，觀察無(wú)出血后逐層縫合關(guān)腹。

1.2.4 術(shù)后管理：術(shù)后給予自由飲食、飲水；仍以普通飼料為飲食，飲自來(lái)水。術(shù)后每天給予腹腔注射環(huán)孢素A 5 mg /（kg·d）、甲潑尼龍琥珀酸鈉10 mg /（kg·d），模擬移植術(shù)后免疫抑制狀態(tài)。

1.2.5 術(shù)后取材：分別于術(shù)后1、2、3周稱(chēng)量體重；眼球摘除法取血，檢測(cè)血清HBsAg表達(dá)。剖腹觀察肝臟腫瘤復(fù)發(fā)率、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量；取下肝臟稱(chēng)重，置于4%甲醛水溶液固定，用于病理學(xué)檢查及免疫組化染色。

本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.2.6.1 肝癌復(fù)發(fā)觀察分級(jí)：Ⅰ級(jí)，單個(gè)小的瘤灶1～5個(gè)（直徑均在1 mm以下）；Ⅱ級(jí)，小的瘤灶在肺內(nèi)彌散分布，6～10個(gè)或單個(gè)中等轉(zhuǎn)移灶（直徑在1～2 mm之間）；Ⅲ級(jí)，小的轉(zhuǎn)移灶呈廣泛分布（幾乎所有肝葉），或存在幾個(gè)大的轉(zhuǎn)移灶（直徑在2 mm以上）。

1.2.6.2 HBsAg檢測(cè)、肝組織病理學(xué)觀察及PCNA、VEGF、ICAM-1的表達(dá)檢測(cè)：血清HBsAg檢測(cè)采用ELISA試劑盒；肝組織病理標(biāo)本以常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色；應(yīng)用免疫組化檢測(cè)肝組織中PCNA、VEGF及ICAM-1的表達(dá)。分別計(jì)算陽(yáng)性指數(shù)：高倍鏡下取5個(gè)不同視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率。采用評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［4］：A為陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率分級(jí)：0%～1%＝0分、1%～10%＝1分、10%～50%＝2分、50%～80%＝3分、80%～100%＝4分；B為陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)：0分（陰性）、1分（弱陽(yáng)性；淡黃色）、2分（陽(yáng)性；棕黃色）、3分（強(qiáng)陽(yáng)性；棕褐色）。免疫反應(yīng)積分（IHS）＝A×B。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)術(shù)前體重、處死時(shí)體重及肝臟的重量（表1）：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后1、2、3周術(shù)前體重（P值分別為0.16、0.27、0.07）、處死時(shí)體重（P值分別為0.48、0.96、0.73）與肝臟重量（P值分別為0.29、0.41、0.20）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)術(shù)前體重、處死時(shí)體重及肝臟重量的比較

2.2 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤復(fù)發(fā)情況（表2）實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后1、2、3周腫瘤復(fù)發(fā)率（P值分別為1、0.653、0.606）及腫瘤復(fù)發(fā)程度分級(jí)比較（P值分別為1、0.935、0.952）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞接種數(shù)及肝癌復(fù)發(fā)情況

2.3 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中HBsAg表達(dá)：實(shí)驗(yàn)組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清HBsAg均為陽(yáng)性，而對(duì)照組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)均為陰性。

2.4 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝組織病理學(xué)改變（圖1）：對(duì)照組（1a）和實(shí)驗(yàn)組（1b）小鼠術(shù)后1周肝組織HE染色偶見(jiàn)灶狀的腫瘤組織，其余肝小葉結(jié)構(gòu)正常；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后2周肝組織HE染色（1c、1d）均可見(jiàn)肝組織內(nèi)片狀的腫瘤病灶，可見(jiàn)核分裂象；術(shù)后3周對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組（1e、1f）肝組織可見(jiàn)現(xiàn)彌漫性腫瘤病變，正常肝組織受壓，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，核分裂象明顯。術(shù)后1、2、3周兩組病理學(xué)改變未見(jiàn)明顯不同。

圖1 光鏡下觀察兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝組織病理學(xué)改變 對(duì)照組小鼠術(shù)后1周（a）和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1周（b）肝組織偶見(jiàn)灶狀的腫瘤組織，其余肝小葉結(jié)構(gòu)正常；對(duì)照組術(shù)后2周（c）和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2周（d）肝組織均可見(jiàn)片狀的腫瘤病灶；對(duì)照組術(shù)后3周（e）和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3周（f）可見(jiàn)彌漫性腫瘤病變，肝組織受壓，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，核分裂現(xiàn)象明顯 HE 高倍放大

2.5 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝組織中PCNA、VEGF及ICAM-1的表達(dá)情況（表3；圖2～4）

2.5.1 光鏡下兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)PCNA的表達(dá)（圖2）：術(shù)后1周對(duì)照組（2a）和實(shí)驗(yàn)組（2b）均可見(jiàn)到腫瘤細(xì)胞核少量表達(dá)，其陽(yáng)性率分別為22.80%±5.51%、22.20%±5.85%；術(shù)后2周對(duì)照組（2c）和實(shí)驗(yàn)組（2d）均可見(jiàn)到腫瘤細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，其陽(yáng)性率分別為43.60%±6.95%、44.20%±6.07%；術(shù)后3周對(duì)照組（2e）和實(shí)驗(yàn)組（2f）均可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)，其陽(yáng)性率分別為56.80%±9.14%、53.40%±7.92%。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間術(shù)后1、2、3周PCNA的陽(yáng)性指數(shù)（P值分別為 0.81、0.84、0.39）和 HIS（P 值分別為 0.40、0.62、0.50）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖2 光鏡下觀察兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝組織PCNA的表達(dá) 術(shù)后1周：對(duì)照組（a）和實(shí)驗(yàn)組（b）均可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞核少量表達(dá)；術(shù)后2周：對(duì)照組（c）和實(shí)驗(yàn)組（d）可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞核表達(dá)均增強(qiáng)；術(shù)后3周：對(duì)照組（e）和實(shí)驗(yàn)組（f）均可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá) 免疫組化 高倍放大

表3 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)PCNA、VEGF及ICAM-1表達(dá)情況比較

圖3 光鏡下觀察兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)VEGF的表達(dá)術(shù)后1周：對(duì)照組（a）和實(shí)驗(yàn)組（b）可見(jiàn)肝竇少量表達(dá)；術(shù)后2周：對(duì)照組（c）和實(shí)驗(yàn)組（d），可見(jiàn)肝竇及腫瘤細(xì)胞間少量表達(dá)；術(shù)后3周：對(duì)照組（e）和實(shí)驗(yàn)組（f）可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞間表達(dá)明顯呈陽(yáng)性免疫組化 高倍放大

2.5.2 光鏡下兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)VEGF的表達(dá)（圖3）：術(shù)后1周對(duì)照組（3a）和實(shí)驗(yàn)組（3b）可見(jiàn)肝竇少量表達(dá)，陽(yáng)性率分別為17.00%±4.14%、20.80%±5.47%；術(shù)后2周對(duì)照組（3c）和實(shí)驗(yàn)組（3d）可見(jiàn)肝竇及腫瘤細(xì)胞間少量表達(dá)，陽(yáng)性率分別為26.70%±6.40%、25.90%±5.51%；術(shù)后3周對(duì)照組（3e）和實(shí)驗(yàn)組（3f）可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞間表達(dá)明顯呈陽(yáng)性，其陽(yáng)性率分別為37.30%±1.42%、37.60%±2.16%。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間術(shù)后1、2、3周VEGF的陽(yáng)性指數(shù)（P值分別為0.09、0.77、0.91）和HIS（P值分別為1、0.64、0.84）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖4 光鏡下觀察兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝ICMA-1的表達(dá) 術(shù)后1周：對(duì)照組（a）和實(shí)驗(yàn)組（b）可見(jiàn)肝組織間少量表達(dá)；術(shù)后2周：對(duì)照組（c）和實(shí)驗(yàn)組（d）可見(jiàn)腫瘤組織少量表達(dá)，陽(yáng)性率分別為22.80±2.97、23.20±3.61；術(shù)后3周：對(duì)照組（e）和實(shí)驗(yàn)組（f）可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞均較多表達(dá)，免疫組化 高倍放大

2.5.3 光鏡下兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)ICAM-1的表達(dá)（圖4）：術(shù)后1周對(duì)照組（4a）和實(shí)驗(yàn)組（4b）可見(jiàn)肝組織間少量表達(dá)，陽(yáng)性率分別為14.50%±3.41%、15.40%±3.89%；術(shù)后2周對(duì)照組（4c）和實(shí)驗(yàn)組（4d）可見(jiàn)腫瘤組織少量表達(dá)，陽(yáng)性率分別為22.80%±2.97%、23.20%±3.61%；術(shù)后3周對(duì)照組（4e）和實(shí)驗(yàn)組（4f）可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞均較多表達(dá)，陽(yáng)性率分別為29.40%±3.69%、31.30%±3.47%。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間術(shù)后1、2、3周ICAM-1的陽(yáng)性指數(shù)（P值分別為0.59、0.79、0.25）和HIS（P值分別為0.79、0.77、0.74）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠肝癌復(fù)發(fā)模型，比較HBsAg陽(yáng)性與HBsAg陰性小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤復(fù)發(fā)情況。結(jié)果顯示，兩組小鼠在腫瘤復(fù)發(fā)率、腫瘤復(fù)發(fā)程度、肝組織病理學(xué)以及免疫組化（PCNA、VEGF及ICAM-1表達(dá)）方面均未見(jiàn)顯著性差異，由此表明在免疫抑制狀態(tài)下血清學(xué)HBsAg陽(yáng)性對(duì)小鼠肝癌復(fù)發(fā)并無(wú)顯著影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與目前研究認(rèn)識(shí)不一致，因?yàn)镠BV是導(dǎo)致肝癌形成的重要因素的觀點(diǎn)已被大量研究所證實(shí)［5-8］。綜合考慮，其原因可能為：① 乙肝病毒導(dǎo)致癌作用并不是在感染病毒之后很快就表現(xiàn)出來(lái)，而是經(jīng)過(guò)一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，或歷經(jīng)肝臟纖維化后才導(dǎo)致腫瘤形成，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠通常需要18月才會(huì)產(chǎn)生原發(fā)性肝癌。所以在肝癌肝移植術(shù)后早期HBsAg陽(yáng)性供肝對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)并未產(chǎn)生影響。② 肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制主要是微轉(zhuǎn)移灶的形成，其對(duì)肝癌復(fù)發(fā)的作用可能要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)HBsAg陽(yáng)性供肝的影響，從而可能掩蓋后者對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的作用。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)脾包膜下接種腫瘤細(xì)胞，是從肝癌復(fù)發(fā)機(jī)制出發(fā)來(lái)建立的動(dòng)物模型，存在較為明顯的微轉(zhuǎn)移灶，因此得出了免疫抑制狀態(tài)下血清學(xué)HBsAg陽(yáng)性對(duì)小鼠肝癌復(fù)發(fā)并無(wú)明顯影響的結(jié)論。③ 由于時(shí)間、技術(shù)和費(fèi)用的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型并未完全符合臨床肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，有可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

肝臟移植目前已成為治療各種終末期肝病和部分肝臟惡性腫瘤的最有效手段之一，但供體缺乏是制約肝移植發(fā)展的最主要瓶頸。邊緣供肝的使用是目前擴(kuò)大供體來(lái)源的主要方式之一［9］。目前，國(guó)內(nèi)外均有應(yīng)用HBsAg陽(yáng)性供肝行肝移植術(shù)的安全性報(bào)道。我們也嘗試應(yīng)用HBsAg陽(yáng)性供肝治療晚期肝癌患者，但術(shù)后患者均死于肝癌復(fù)發(fā)。因此HBsAg陽(yáng)性供肝是否會(huì)促進(jìn)肝癌患者腫瘤復(fù)發(fā)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HBsAg陽(yáng)性在免疫抑制狀態(tài)下對(duì)肝癌復(fù)發(fā)無(wú)顯著影響。本實(shí)驗(yàn)部分模擬HBsAg陽(yáng)性供肝對(duì)肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的動(dòng)物模型，這對(duì)研究HBsAg陽(yáng)性供肝對(duì)肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的影響具有一定的指導(dǎo)意義。因此，筆者認(rèn)為在HBV相關(guān)的肝癌患者中，可考慮應(yīng)用HBsAg陽(yáng)性供肝行肝移植術(shù)。該方法是安全有效的，一方面能夠使患者縮短等待供體時(shí)間，提高患者預(yù)后，另一方面能夠在一定程度上緩解供肝短缺的窘境，具有非常重要的意義。