嘧肽·嗎啉胍對煙草PVYN的抑制作用及對寄主防御酶活性的影響

周建全 張忠光 蘇燕妮 董雪

摘要：為了明確嘧肽·嗎啉胍對馬鈴薯Y病毒壞死株系（Potato virus Y necrosis strain，PVYN）的抑制作用及誘導(dǎo)寄主的抗性反應(yīng)，采用紫外分光光度計(jì)和ELISA法研究了嘧肽·嗎啉胍對煙草中PVYN濃度的影響。結(jié)果表明，嘧肽·嗎啉胍可明顯降低感病植物體內(nèi)PVYN的濃度，抑制率達(dá)32.71%～68.73%。并檢測不同處理下煙草體內(nèi)過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）及超氧化物歧化酶（SOD）的變化，嘧肽·嗎啉胍能誘導(dǎo)煙草體內(nèi)PPO、POD、PAL及SOD的活性提高，說明該藥劑可誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性。

關(guān)鍵詞：嘧肽·嗎啉胍；PVYN；抑制作用；防御酶

中圖分類號：S432.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5306-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.025

Inhibition of Cytosinpeptidemycin Moroxydine Hydrochloride（CyMH） against PVYN and Effect on Activities of Protective Enzymes in Tobacco

ZHOU Jian-quan1，ZHANG Zhong-guang1，SU Yan-ni2，DONG Xue2

（1.Liaoning Province Tobacco Cooperation of Fuxin， Fuxin 123000， Liaoning， China；

2. College of Plant Protection， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract： The systemic resistance and inhibition of CyMH against Potato virus Y necrosis strain（PVYN） was determined. The influence of CyMH on the concentration of PVYN in plant were tested by UV absorption and ELISA.The results indicated that the concentration of PVYN were decreased after treated by CyMH， the inhibition rate was 32.71%～68.73%.Activities of POD， PAL， PPO， SOD in tobacco were detected under different treatments（treated with water，PVYN，CyMH）.The results showed that the tobacco treated with CyMH can induce defensive enzymes activity of tobacco（PPO，POD，PAL and SOD），and CyMH could induced resistance on the host.

Key words：CyMH；PVYN；inhibition；protective enzymes

馬鈴薯Y病毒脈壞死株系是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要植物病毒之一。每年由于感染該病毒導(dǎo)致減產(chǎn)所造成的損失相當(dāng)嚴(yán)重。PVYN在中國的發(fā)生和危害有急劇上升的趨勢，已成為中國的主要病毒種類[1-3]。因此，為了保證農(nóng)作物質(zhì)量及產(chǎn)量，有效的防治PVYN是目前急需解決的問題之一。目前抗病毒藥劑主要通過抑制病毒的增殖、轉(zhuǎn)運(yùn)及癥狀的表達(dá)來抑制病毒的復(fù)制和運(yùn)輸，藥劑抑制以上任一過程都可減輕植物病毒的危害。還發(fā)現(xiàn)一些通過誘導(dǎo)植物抵抗病毒來抑制病毒增殖的藥劑，這已成為目前研究抗植物病毒藥劑的熱點(diǎn)。PAL、POD、PPO和SOD是4種極為重要的防御酶，與植物的抗病性關(guān)系密切[4-8]。檢測防御酶對病毒侵染的反應(yīng)是室內(nèi)鑒定植物抗病性的重要途徑，可以將防御酶活性的檢測作為煙草抗病性鑒定的一個輔助手段。王小青等[9]采用溫度轉(zhuǎn)換和人工接種試驗(yàn)研究了接種TMV的煙草經(jīng)高溫脅迫后防御酶活性的變化，證明了PAL、POD、PPO活性的變化可能與高溫誘發(fā)煙草對TMV的抗性有關(guān)。顧晶晶等[10]對硫酸鎂對煙草感染PVYN后病情及防御酶系活性進(jìn)行了檢測，處理后的煙草PAL、POD、PPO酶的活性有明顯的升高，參與了煙草抗病性的反應(yīng)。本試驗(yàn)采用藥劑嘧肽·嗎啉胍處理普通煙K326，探討其對PVYN病毒的抑制作用及對煙草防御酶活性的誘導(dǎo)作用，為深入研究煙草抗病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為普通煙K326，PVYN由筆者所在研究室分離提純并繁殖保存在無蟲溫室中的高感品種K326上。為防止保存期病毒致病性發(fā)生變異，在使用前15 d轉(zhuǎn)接到K326煙苗上復(fù)壯。

1.2 接種方法

采用常規(guī)汁液摩擦接種法接種，當(dāng)普通煙長至4～5葉期時即可接種。選取長勢一致的植株，噴灑400目金剛砂，蘸取接種液輕輕摩擦葉片2～3片，接種后5～10 min用自來水輕輕沖洗葉片，試驗(yàn)在20～30 ℃溫室內(nèi)進(jìn)行。

1.3 植物體內(nèi)病毒濃度的測定

1.3.1 處理方法 取長勢一致的普通煙K326，接種病毒前24 h與接種病毒后24 h噴灑嘧肽·嗎啉胍700倍稀釋液、藥劑與PVYN等體積混合后1 h摩擦煙葉、噴清水作為空白對照（接種PVYN）。

1.3.2 紫外分光光度計(jì)法 取5～6葉期的煙草高感品種K326，處理同“1.3.1”，以噴清水為陽性對照，待陽性對照全部顯癥時，采取不同對照組發(fā)病煙草的上部葉片保存于裝有液氮的保溫瓶中，提純PVYN病毒[11]。病毒濃度的測定采用紫外分光光度計(jì)（Nanodrop-ND-1000紫外可見分光光度計(jì)）法[12]，比較PVYN病毒在260 nm及280 nm處光吸收值之比與標(biāo)準(zhǔn)病毒蛋白與核酸含量的固定比值，用A260 nm來計(jì)算PVYN病毒的濃度。

病毒濃度//mg/mL=■

E為消光系數(shù)，即在波長260 nm時，濃度為0.1%（1 mg/mL）的懸浮液，光程為1 cm時的光（光密度）吸收值。

標(biāo)準(zhǔn)PVYN的E0.1%1 cm260 nm =2.8，A260/A280=1.28。

1.3.3 ELISA法 取5～6葉期的煙草高感品種K326，處理同1.3.1，處理后每隔2 d取一次樣， 采用ELISA法檢測不同處理下PVYN的濃度變化。取PVYN的一抗4 ℃包被過夜，洗板后加入樣品，室溫下孵育2 h。洗板后加入PVYN的二抗，室溫下孵育2 h。以PNP溶液為底物，在405 nm下測OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒濃度。

1.4 煙草主要防御酶系活性的測定

1.4.1 煙草的處理 選取長勢一致的煙草K326進(jìn)行如下處理：①煙草噴清水作對照；②煙草接種PVYN病毒；③煙草噴嘧肽·嗎啉胍。每個處理重復(fù)3次，于處理后的1、3、5、7、9、11、13 d取樣，于-20 ℃保存。

1.4.2 酶液的粗提 參照逢麗麗等[13]的方法，取1 g樣品置于裝有液氮的研缽中快速研磨成粉末，加入1.5 mL硼酸緩沖液（0.2 mol/L pH 8.8的硼酸緩沖液含1×10-3 moL/L EDTA、5 mmol/L二硫蘇糖醇）繼續(xù)研磨成勻漿，收集勻漿液，再取1.5 mL上述緩沖液加入到研缽中沖洗殘余，將得到的液體轉(zhuǎn)移至同一離心管中，10 000 r/min、4 ℃離心25 min，上清液即為酶粗提液，-20 ℃保存待用。

1.4.3 酶活性測定 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性參照Koukol等[14]的方法測定，多酚氧化酶（PPO）參考薛應(yīng)龍[15]的方法測定；過氧化物酶（POD）參考朱廣廉[16]的方法測定，SOD參考朱春玉[17]的方法測定。以上每個樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥劑處理后植株體內(nèi)病毒濃度的變化

2.1.1 分光光度法測定結(jié)果 采用分光光度法測定藥劑處理后的病毒濃度，結(jié)果（表1）表明，嘧肽·嗎啉胍可以有效地減輕PVYN感染煙草后的發(fā)病癥狀，同時使植株體內(nèi)的PVYN的濃度降低。接種病毒前24 h噴灑嘧肽·嗎啉胍，抑制率為54.90%；接種病毒后24 h噴灑嘧肽·嗎啉胍藥劑，抑制率為32.71%；藥劑與病毒混合后1 h再接種，抑制率高達(dá)68.73%，效果最好。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了嘧肽·嗎啉胍能降低植株體內(nèi)的病毒濃度，對病毒的復(fù)制和增殖有一定的抑制作用，從而控制PVYN對煙草的危害。

2.1.2 間接ELISA法測定結(jié)果 ELISA法試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，嘧肽·嗎啉胍可以有效的降低植株體內(nèi)的病毒濃度。嘧肽·嗎啉胍與PVYN等體積混合后1 h接種煙草K326，接種后2～3周，寄主植株體內(nèi)的病毒濃度均低于對照組。接種前24 h和接種后24 h噴藥處理的植株體內(nèi)的病毒濃度，在前12 d均較低，12 d以后寄主體內(nèi)病毒濃度均有一定幅度的增加，但明顯低于對照組，表明該藥劑在抑制病毒增殖的某一過程起到一定的作用。

2.2 噴藥處理后POD活性的變化

試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，接種PVYN及噴灑嘧肽·嗎啉胍的煙草體內(nèi)酶活性明顯高于對照。噴灑清水處理的煙草體內(nèi)POD酶活性從第5天開始上升，第9天開始趨于平穩(wěn)。接種PVYN后第5天POD活性達(dá)到一個小高峰，隨后下降，第11天又出現(xiàn)一次高峰，此時POD活性達(dá)到最大，隨后開始下降，但其活性仍高于清水對照。單獨(dú)噴灑嘧肽·嗎啉胍處理的在第9天出現(xiàn)酶活高峰，而且植株體內(nèi)POD活性始終高于清水對照，表明嘧肽·嗎啉胍可在一定程度上誘導(dǎo)寄主體內(nèi)POD酶活性的升高。

2.3 噴藥處理后PAL活性的變化

PAL作為一種關(guān)鍵酶，在植物苯丙烷類代謝中裂解苯丙氨酸、合成酚類化合物、木質(zhì)素，與植物抗病性關(guān)系密切。試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，清水對照處理在第3天到第7天PAL活性急速升高，可能是由于澆水時對煙苗造成機(jī)械損傷，誘導(dǎo)PAL酶活性升高；單獨(dú)接種病毒處理的第7天出現(xiàn)酶活高峰，可能是由于PVYN侵染所致；藥劑處理后，煙草葉片中的PAL的活性于第5天達(dá)到高峰，隨后呈下降趨勢，第9天又出現(xiàn)一個小高峰，但始終高于清水及接種PVYN對照組，由此可見，嘧肽·嗎啉胍可明顯誘導(dǎo)寄主PAL活性的升高。

2.4 噴藥處理后PPO活性的變化

試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，各處理的PPO活性整體均呈上升趨勢；對照在第11天出現(xiàn)酶活高峰，但在整個測定時間里均低于其他2個處理；單獨(dú)接種病毒處理的第7天出現(xiàn)酶活高峰，可能是由于PVYN侵染所致；單獨(dú)噴藥處理的第11天出現(xiàn)酶活高峰，且均高于其他2個處理。由此可見，嘧肽·嗎啉胍可明顯誘導(dǎo)寄主PPO活性的升高。

2.5 噴藥處理后SOD活性的變化

SOD是抗氧化活性酶，主要功能是專一清除氧自由基。試驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，3種處理SOD活性波動較大，但整體趨勢一致。煙草在噴灑嘧肽·嗎啉胍和接種病毒處理第5天之后SOD活性均高于清水對照，噴灑藥劑處理組在第5天出現(xiàn)酶活高峰，隨后有所降低，但整體高于其他處理。由此可見，嘧肽·嗎啉胍可明顯誘導(dǎo)寄主SOD活性的升高。

3 結(jié)論與討論

3.1 藥劑處理后植株體內(nèi)病毒濃度的變化

本試驗(yàn)采用紫外分光光度法和ELISA法對噴灑嘧肽·嗎啉胍后植株體內(nèi)PVYN病毒濃度的變化進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，噴藥后植株體內(nèi)病毒濃度均明顯低于清水對照，2種檢測方法結(jié)果趨勢一致，證明嘧肽·嗎啉胍對植物體內(nèi)的PVYN復(fù)制和增殖具有一定的抑制作用，從而降低寄主植株體內(nèi)的病毒濃度，達(dá)到防治效果。由于藥劑的處理方式不同，其防效也大有不同，說明嘧肽·嗎啉胍抑制病毒的作用方式是多方面的，它既可以保護(hù)寄主，防止病毒的進(jìn)入，又可以對寄主起到治療的作用，還可以在體外使病毒失去侵染能力，但是其作用方式和作用位點(diǎn)尚不清楚，還有待于進(jìn)一步的研究。

3.2 藥劑對煙草主要防御酶系的影響

嘧肽·嗎啉胍不僅對PVYN有較好的抑制作用，還可以通過提高寄主植物的抗病性達(dá)到防病的目的。防御酶系酶活性的升高與植物抗病性有一定相關(guān)性。本試驗(yàn)測定了其對煙草植株主要防御酶系的酶活性，結(jié)果表明，嘧肽·嗎啉胍可誘導(dǎo)PPO、POD、PAL、SOD酶活提高。

在苯丙烷類代謝過程中，PAL是關(guān)鍵酶，其活性水平除受光、損傷、病害、激素及其他外界條件的影響外，還受內(nèi)源物質(zhì)的控制。隨著時間的延長，上述3個處理都產(chǎn)生了酶活高峰，可能是由于病毒的繁殖和侵染導(dǎo)致寄主細(xì)胞被破壞，從而刺激寄主植物PAL活性的提高。POD參與木質(zhì)素的聚合作用并清除體內(nèi)活性氧。近年來許多學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識到POD活性與植物抗病性的相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)病組織中POD活性明顯增強(qiáng)[18，19]。本研究結(jié)果表明，各處理POD活性均有不同程度的提高。POD可催化形成木質(zhì)素和植保素等次生抗性物質(zhì)，進(jìn)而可抵抗和限制病毒粒子的侵入和擴(kuò)散。PPO可催化參與酚類物質(zhì)代謝，形成的咖啡酸、綠源酸等具有抗病作用，形成的預(yù)苯酸是木質(zhì)素的前提。嘧肽·嗎啉胍處理可誘導(dǎo)煙草幼苗產(chǎn)生較高的PPO活性，由它催化所形成的醌類物質(zhì)限制了病毒粒子的繁殖和擴(kuò)散。SOD是一種催化超氧化物轉(zhuǎn)為過氧化物的酶，可以阻礙·O2-自由基的形成。所以SOD被認(rèn)為是·O2-自由基的消除劑。SOD活性高，在一定程度上說明該植株的耐病性或抗病性高。

參考文獻(xiàn)：

[1] 胡新喜，何長征，熊興耀，等.馬鈴薯Y病毒研究進(jìn)展[J].中國馬鈴薯，2009，23（5）：293-300.

[2] 孫劍萍，孫宏偉，虞艷芳.煙草馬鈴薯Y病毒病發(fā)病的相關(guān)因素研究[J].中國煙草科學(xué)，2011，32（6）：80-84.

[3] 崔曉艷，魏太云，陳 新.馬鈴薯Y病毒屬病毒的細(xì)胞生物學(xué)研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012，45（7）：1293-1302.

[4] RENARD-MERLIER D，RANDOUX B，NOWAK E，et al.Iodus40， salicylic acid， heptanoyl salicylic acid and trehalose exhibit different efficacies and defence targets during a wheat/powdery mildew interaction[J].Phytochemistry，2007，68（8）：1156-1164.

[5] JIN Y，HOU L Y，ZHANG M Z， et al.Antiviral activity of Eupatorium adenophorum leaf extract against tobacco mosaic virus [J].Crop Protection，2014， 60：28-33.

[6] LUO Y， ZHANG D D， DONG X W，et al. Antimicrobial peptaibols induce defense responses and systemic resistance in tobacco against tobacco mosaic virus[J]. FEMS Microbiology Letters，2010，313（2）：120-126.

[7] 馬 鏑，趙秀香，吳元華.殼寡糖對煙草花葉病毒的抑制作用及其對煙草酶活性的影響[J].中國生物防治，2008，24（2）：154-158.

[8] 吳元華，鐘麗娟，趙秀香.煙草感染PVYN后葉脈壞死與總酚、類黃酮及PPO關(guān)系研究[J].植物病理學(xué)報，2007，37（4）：398-402.

[9] 王小青，趙 志，蔣士君，等.接種TMV的煙草高溫脅迫后防御酶活性的變化[J].煙草科技，2006（12）：51-54.

[10] 顧晶晶，李 鑫，趙秀香，等.硫酸鎂對煙草感染PVYN后病情及防御酶系活性的影響[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，40（3）：286-290.

[11] RUPAR M，RAVNIKAR M，TU？譒EK-？譕NIDARI■M. et al. Fast purification of the filamentous potato virus Y using monolithic chromatographic supports[J]. Journal of Chromatography A，2013，1272：33-40.

[12] 董 丹，王春梅，吳元華.嘧肽霉素復(fù)配制劑06抗病毒機(jī)理初探[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（4）：593-596.

[13] 逢麗麗，宋寶安，汪 華，等.寧南霉素、病毒A、娃兒藤堿對煙草花葉病毒的室內(nèi)毒力活性測定[J].農(nóng)藥，2005，44（4）：176-178.

[14] KOUKOL J，CONN E E. The metabolism of aromatic compounds in higher plans. Ⅳ.Purification and properties of the phenylalanine deaminase of Hordeum vulgare[J]. The Journal of Biological Chemistry，1961，236（10）： 2692-2698.

[15] 薛應(yīng)龍.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985.191-192.

[16] 朱廣廉.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：北京科學(xué)出版社，1990.37-40.

[17] 朱春玉.嘧肽霉素抗煙草花葉病毒（TMV）作用機(jī)制研究[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[18] BURKHANOVA G F，YARULLINA L G，MAKSIMOV I V. The control of wheat defense responses during infection with Bipolaris sorokiniana by chitooligo-saccharides[J]. Russian Journal of Plant Physiology，2007，54（1）：104-110.

[19] CHAKRABORTY M，KARUN A，MITRA A. Accumulation of phenylpropanoid derivatives in chitosan-induced cell suspension culture of cocosnucifera[J]. Journal of Plant Physiology，2009，166（1）：63-71.