小黑麥花粉干燥法超低溫保存技術(shù)研究

徐翠蓮 王瑞清 張俐敏 田依軒 胡文明

摘要：為了滿(mǎn)足種質(zhì)資源保存、交換及雜交育種工作的需求，對(duì)小黑麥花粉活力及影響小黑麥花粉超低溫保存效果的因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，采用TTC染色法測(cè)定小黑麥花粉的活力，結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，且其適合的濃度為0.1%；采用硅膠干燥處理3 h后，小黑麥花藥相對(duì)含水量為34.5%，比較適合超低溫保存，且保存前后花粉活力保持穩(wěn)定，其活力相對(duì)保持率為92.3%；超低溫冷凍保存5 d后，采用不同的化凍方式進(jìn)行化凍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自來(lái)水沖洗化凍后小黑麥花粉活力相對(duì)較高，說(shuō)明自來(lái)水沖洗化凍是簡(jiǎn)便適合的化凍方式。

關(guān)鍵詞：小黑麥；花粉活力；花粉相對(duì)含水量；超低溫保存；化凍方式

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）21-5223-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.006

Studies on Cryopreservation of Triticale Pollen after Drying Treatment

XU Cui-lian， WANG Rui-qing， ZHANG Li-min， TIAN Yi-xuan. HU Wen-ming

（College of Plant Science， Tarim University， Alar 843300， Xinjiang， China）

Abstract： In order to meet the demands of germplasm resources preservation， exchange and cross breeding， triticale pollen vitality and the cryopreservation-influencing factors were studied in this research. The results showed that， TTC staining method was relatively accurate for determining the triticale pollen vitality， and the suitable concentration was 0.1%； moreover， it was more suitable for cryopreservation when relative water content of anther reached to 34.5% after dried three hours by silica gel， which made pollen vitality stable and its vitality relative retention rate was 92.3%.In addition， different ways of defrosting were studied after five days of cryopreservation， and the results showed that the pollen vitality was relatively high when adopting method of tap water washing， indicating that tap water defrosting was more simple and applicable.

Key words： triticale； pollen vitality； relative water content of triticale anther； cryopreservation； ways of defrosting

花粉是種子植物特有的生殖器官的一部分?；ǚ刍盍χ赋墒斓幕ǚ墼陔x體條件下存活且一段時(shí)間內(nèi)授粉具備結(jié)實(shí)能力。然而不同植物花粉活力持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)短不同，即壽命不同。因此，充分了解植物花粉的生活力特性在植物種質(zhì)資源保存等研究中具有重要的意義。

花粉壽命的長(zhǎng)短，除受到遺傳因素決定外，還受環(huán)境的影響[1，2]。其中對(duì)花粉活力影響較大的環(huán)境因素是貯藏溫度和花粉本身的含水量?；ǚ圪A藏常見(jiàn)的方法有低溫干燥法、真空貯藏法、凍干貯藏法、超低溫貯藏法、有機(jī)溶劑保存法等。其中超低溫貯藏法利用液態(tài)氮將花粉貯藏在-196 ℃條件下，被認(rèn)為是目前實(shí)現(xiàn)花粉種質(zhì)“永久”的最理想的方法之一。花粉的超低溫保存能解決諸如制種中花時(shí)花期不遇的問(wèn)題，能使不同時(shí)間開(kāi)花、花期不一致的植物正常授粉結(jié)實(shí)，也能使不同地點(diǎn)開(kāi)花的植物實(shí)現(xiàn)正常的授粉結(jié)實(shí)?；ǚ鄣某蜏乇４婕夹g(shù)在果樹(shù)、林木[3，4]和花卉[5-8]中研究或應(yīng)用較多，但在作物中研究的較少[9-11]。

禾本科植物花粉壽命很短，一般在開(kāi)花散粉后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)花粉活力降低很快，不利于花粉活力研究和育種工作的開(kāi)展。因此，采用超低溫冷凍技術(shù)延長(zhǎng)花粉壽命為麥類(lèi)遠(yuǎn)緣雜交育種和種質(zhì)資源的保存、交流提供便捷的途徑，有一定的應(yīng)用價(jià)值。鑒于目前超低溫保存技術(shù)在保存植物花粉中的應(yīng)用可以發(fā)現(xiàn)，花粉材料的種間特異性很強(qiáng)，不同種植物的花粉超低溫保存可能需要不同的技術(shù)方案，還沒(méi)有找到一種可以適用于所有花粉超低溫保存的技術(shù)方案。本研究擬對(duì)不同小黑麥品種的花粉進(jìn)行超低溫保存研究，旨在確立小黑麥花粉超低溫冷凍保存的技術(shù)，為小黑麥育種，尤其是跨時(shí)間、跨地區(qū)的雜交育種提供方便，同時(shí)為禾本科花粉的長(zhǎng)期冷凍保存提供理路依據(jù)和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)條件

供試材料為新小黑麥1號(hào)、新小黑麥3號(hào)、新小黑麥4號(hào)和新小黑麥5號(hào)，由石河子大學(xué)麥類(lèi)作物研究所提供。試驗(yàn)于2012—2013年在塔里木大學(xué)園藝試驗(yàn)站和園藝實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，重復(fù)2次，每小區(qū)種植10行，行長(zhǎng)3 m，行距15 cm，四周設(shè)保護(hù)行。試驗(yàn)地肥力中等，試驗(yàn)田基施220 kg/hm2尿素、150 kg/hm2磷酸二銨，拔節(jié)期隨水施80 kg/hm2尿素、60 kg/hm2 KH2PO4，揚(yáng)花灌漿期施70 kg/hm2尿素、60 kg/hm2 KH2PO4。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉活力及花藥相對(duì)含水量測(cè)定 于小黑麥揚(yáng)花期的晴天上午10：00左右，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、當(dāng)日待開(kāi)花散粉的麥穗20個(gè)，減去1/3穎殼，用鑷子撥出花藥，備用。將花藥裝入1.5 mL離心管，采用室溫自然干燥（A）和干燥皿內(nèi)硅膠干燥（B）2種方法進(jìn)行干燥，每隔1 h分別取少許花粉進(jìn)行花粉活力及含水量測(cè)定，其余的用于超低溫保存，以未經(jīng)干燥處理的花粉及花粉直接投入液氮進(jìn)行超低溫保存為對(duì)照。

花粉活力測(cè)定：取少許花粉于載玻片上，分別采用碘-碘化鉀（I2-KI）溶液、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，以75%乙醇處理的花粉為對(duì)照。每個(gè)處理制作2～3個(gè)制片，于30 ℃恒溫箱中放置20～30 min后鏡檢。每個(gè)制片隨機(jī)選取5個(gè)視野，記錄花粉總數(shù)和有活力花粉的數(shù)目，取其平均值，計(jì)算花粉活力。

花藥相對(duì)含水量測(cè)定：采用烘干法。將離心管在120 ℃的烘箱中烘至恒重w1，然后放入適量（0.1～0.2 g）花粉，稱(chēng)重得數(shù)據(jù)w2，每隔1 h分別取樣放入120 ℃烘箱中烘至恒重，取出放入干燥皿內(nèi)冷卻后稱(chēng)重，記下讀數(shù)w3?；ㄋ幭鄬?duì)含水量y=（w2-w3）/（w2-w1）×100%，2次重復(fù)。

1.2.2 花粉的超低溫保存及化凍處理 將新鮮花粉或經(jīng)干燥處理的花粉裝入凍存管，投入液氮（-196 ℃）進(jìn)行貯藏，24 h后取出花粉，分別采用自來(lái)水沖洗化凍、室溫化凍、37 ℃水浴化凍，待恢復(fù)至室溫后進(jìn)行測(cè)定，記錄保存前后花粉的活力，計(jì)算花粉活力相對(duì)保持率?；ǚ刍盍ο鄬?duì)保持率=保存后花粉活力/保存前花粉活力×100%。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，用Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力測(cè)定方法的篩選與確定

花粉活力代表了花粉的生活能力，有活力的花粉可以用于雜交授粉，完成植物受精過(guò)程。新鮮的花粉粒是最富有生命力的，但在雜交育種實(shí)踐中，由于各種植物花粉的壽命長(zhǎng)短不同和花期不一致，需要把花粉保存一段時(shí)間再用，或因需要從其他地方運(yùn)來(lái)花粉。因此，授粉前快速測(cè)定花粉活力顯得十分有必要。

取新小黑麥3號(hào)的新鮮花粉，分別采用I2-KI、TTC染色法測(cè)定其花粉活力，染色結(jié)果（圖1）表明，利用I2-KI對(duì)小黑麥花粉進(jìn)行染色，花粉呈現(xiàn)藍(lán)色和褐色2種顏色，且染色效果不隨時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生變化。成熟的花粉粒呈球形，積累較多的淀粉，I2-KI溶液可將其染成藍(lán)色，而發(fā)育不良的花粉呈畸形，往往不含淀粉或積累淀粉較少，I2-KI溶液染色呈黃褐色，失活的花粉以及經(jīng)過(guò)乙醇處理的花粉（對(duì)照）遇碘同樣呈藍(lán)色反應(yīng)。因而I2-KI溶液染色法不能很好地區(qū)分有活力的花粉和已喪失活力的花粉。利用TTC染色，花粉細(xì)胞出現(xiàn)紅色、淡紅色和無(wú)色3種顏色反應(yīng)，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞的染色率逐漸下降?；ǚ劢?jīng)乙醇處理后（對(duì)照）失活，用TTC染色，不能著色。說(shuō)明TTC染色法測(cè)定小黑麥花粉活力相對(duì)準(zhǔn)確。本研究用1%TTC進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新小黑麥3號(hào)的新鮮花粉染色率相對(duì)較低，為50%左右，分析認(rèn)為是高濃度的TTC對(duì)花粉細(xì)胞有毒害作用。而用0.1%TTC和0.5%TTC染色后花粉著色率相對(duì)較高，分別為92.3%和79.1%。方差分析表明，不同濃度TTC染色液染色結(jié)果間存在極顯著（P<0.01）差異。因此，TTC溶液濃度為0.1%時(shí)較適合用來(lái)測(cè)定小黑麥花粉的活力。

2.2 花藥相對(duì)含水量的測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，隨著干燥時(shí)間的延長(zhǎng)，新小黑麥1號(hào)的花藥相對(duì)含水量逐漸降低，與室溫自然干燥相比，采用硅膠干燥法水分散失較快，干燥效果相對(duì)較好。正在散粉的小黑麥花藥的初始相對(duì)含水量平均為71.65%，干燥處理1～3 h內(nèi)水分散失較快，3 h后室溫干燥花藥含水量達(dá)到45.8%，硅膠干燥花藥含水量達(dá)到34.5%，7 h后花藥相對(duì)含水量分別為18.5%、10.0%。對(duì)花藥相對(duì)含水量（y）和干燥時(shí)間（x）進(jìn)行擬合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自然干燥和硅膠干燥的花藥相對(duì)含水量與干燥時(shí)間均呈極顯著（P<0.01）負(fù)指數(shù)關(guān)系，擬合方程分別為：y=91.71×EXP（-0.182x），r2=0.967 9；y=102.47×EXP（-0.293x），r2=0.992 9。

2.3 花藥相對(duì)含水量對(duì)小黑麥花粉超低溫保存效果的影響

分別將新小黑麥1號(hào)的新鮮花粉（P1）、硅膠干燥處理3 h（P2）和6 h（P3）的花粉投入液氮保存5、10 d后，取出在自來(lái)水下快速化凍測(cè)定其花粉活力，結(jié)果如表1所示。由表1可知，在超低溫保存下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)不同處理的花粉活力變化趨勢(shì)明顯不同。經(jīng)過(guò)硅膠干燥處理3 h的花粉放入液氮經(jīng)超低溫冷凍保存后，其活力基本呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)，最終活力穩(wěn)定在78.0%，保存前后花粉活力相對(duì)保持率為92.3%。這是由于干燥處理后的花粉相對(duì)含水量低，在超低溫保存及化凍過(guò)程中不易產(chǎn)生冰晶，花粉活力基本保持不變。新鮮花粉在超低溫保存前后的活力變化很大，保存5 d和10 d后花粉活力分別由99.8%降低至44.5%和28.6%，這是由于新鮮花粉含水量高，在結(jié)凍與化凍的過(guò)程中容易產(chǎn)生冰晶使細(xì)胞膜受損。經(jīng)硅膠干燥處理6 h的花粉在投入液氮前活力已經(jīng)很低，不適合保存，這是由于小黑麥的花粉是三核型花粉，不耐干燥，延長(zhǎng)干燥時(shí)間會(huì)導(dǎo)致小黑麥花粉活力降低，經(jīng)過(guò)超低溫保存后活力很低，最終花粉活力保持率為36.1%。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，經(jīng)硅膠干燥處理3 h的花粉在超低溫保存前后，其花粉活力差異不顯著（P>0.05）。因此，硅膠干燥3 h的花粉比較適合小黑麥花粉的超低溫保存。液氮超低溫冷凍保存是相對(duì)較為理想的保存方式，相對(duì)干燥的小黑麥花粉的活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不會(huì)出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，理論上可以長(zhǎng)時(shí)間保存。

2.4 化凍方法對(duì)小黑麥花粉超低溫保存效果的影響

分別取新小黑麥1號(hào)、新小黑麥3號(hào)、新小黑麥4號(hào)和新小黑麥5號(hào)的花粉在硅膠中干燥處理3 h后進(jìn)行超低溫冷凍保存，保存5 d后取出，分別采用室溫（23 ℃）、37 ℃水浴和自來(lái)水沖洗化凍3種方法進(jìn)行化凍處理，30 min后測(cè)定其花粉活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，新小黑麥1號(hào)、新小黑麥3號(hào)、新小黑麥4號(hào)和新小黑麥5號(hào)的花粉在液氮保存5 d后，采用自來(lái)水沖洗化凍，其最終的花粉活力最高，37 ℃水浴化凍的活力次之，室溫下自然化凍的花粉活力最低。顯著性檢驗(yàn)表明，新小黑麥1號(hào)和新小黑麥3號(hào)在37 ℃水浴化凍和自來(lái)水沖洗化凍下花粉活力差異不顯著（P>0.05），但二者顯著（P<0.05）高于室溫化凍時(shí)的活力；而新小黑麥4號(hào)和新小黑麥5號(hào)在不同化凍方式下均存在顯著差異（P<0.05），以自來(lái)水沖洗化凍方式花粉活力最高。因此，用自來(lái)水沖洗化凍是簡(jiǎn)便適合的化凍方式。

3 結(jié)論與討論

3.1 花粉活力測(cè)定方法的篩選與確定

多數(shù)植物正常的成熟花粉粒呈球形，積累較多的淀粉，I2-KI溶液可將其染成藍(lán)色；而發(fā)育不良的花粉往往不含淀粉或積累淀粉較少，染色呈黃褐色，而已喪失活力的花粉和經(jīng)過(guò)乙醇處理的花粉（對(duì)照）因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)存在有淀粉，遇碘同樣呈藍(lán)色反應(yīng)。因而I2-KI溶液染色不能很好地區(qū)分有活力的花粉和無(wú)活力的花粉，不適用于對(duì)小黑麥花粉活力的測(cè)定。

TTC是呼吸鏈系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，凡被染為紅色的花粉活力強(qiáng)，淡紅色次之，無(wú)色的為沒(méi)有活力或不育花粉，因此花粉細(xì)胞出現(xiàn)紅色、淡紅色和無(wú)色3種顏色反應(yīng)。對(duì)照花粉經(jīng)乙醇處理后失活，用TTC染色不能著色，說(shuō)明TTC染色結(jié)果能很好地區(qū)分有活力的花粉和無(wú)活力的花粉，適合小黑麥花粉活力的測(cè)定。另外，高濃度的TTC對(duì)花粉細(xì)胞的毒性作用會(huì)導(dǎo)致某些有活力的花粉隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸褪色，使試驗(yàn)結(jié)果偏低。本研究將TTC溶液濃度降低到0.1%，染色效果較好。

3.2 花藥相對(duì)含水量和貯藏溫度對(duì)花粉活力的影響

新鮮花藥的含水量較高，其活力和萌發(fā)力較高?；ㄋ幒吭礁撸M(jìn)行低溫貯藏時(shí)越容易形成冰晶，使細(xì)胞膜受損，花粉死亡率就越高，達(dá)不到貯藏的目的。所以為了避免冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，提高花粉存活率，在冷凍保存之前必須對(duì)花粉進(jìn)行干燥脫水處理。進(jìn)行花粉干燥既要把含水量降低，控制在一定范圍之內(nèi)，又要保證花粉保持較高活力和萌發(fā)力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小黑麥的花藥相對(duì)含水量在30%左右時(shí)是放入液氮內(nèi)保存的最佳時(shí)期。

本研究結(jié)果認(rèn)為，超低溫和干燥處理是花粉活力得以延長(zhǎng)的必要條件，這與前人的結(jié)果一致[12-14]。超低溫降低了花粉內(nèi)部呼吸強(qiáng)度，而花粉保存前的干燥處理抑制了花粉代謝，降低了酶的活力，避免了花粉冷凍和化凍過(guò)程中的傷害，從而使花粉壽命得以延長(zhǎng)。

3.3 化凍方法對(duì)小黑麥花粉活力的影響

花粉的化凍方式一般有自然化凍、室溫化凍、自來(lái)水沖洗化凍等幾種方式。許多研究認(rèn)為，液氮保存對(duì)植物的傷害是在冰凍和化凍兩個(gè)過(guò)程中發(fā)生的，因此要使植物花粉的超低溫保存獲得成功，選擇合適的化凍方法是最重要的。較好的化凍方式既能避免在化凍過(guò)程中產(chǎn)生花粉細(xì)胞內(nèi)的再次結(jié)冰，又能防止在化凍吸水過(guò)程中水的滲透沖擊對(duì)細(xì)胞膜體系的破壞。研究結(jié)果表明，超低溫保存材料在化凍時(shí)再次結(jié)冰的危險(xiǎn)溫度區(qū)大約是-5～10 ℃[14]，所以化凍一般在35～40 ℃溫水中進(jìn)行，借助迅速的化凍速度通過(guò)此溫度區(qū)，避免細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰對(duì)細(xì)胞的致死性破壞。王彩紅等[15]采用0、16、37 ℃ 3種溫度進(jìn)行化凍，研究顯示含水量為7.3%的材料采用任何一種化凍溫度都獲得良好效果，花粉含水量較高時(shí)采用37 ℃溫水化凍較好。本試驗(yàn)采用37 ℃水浴、自來(lái)水沖洗、自然化凍3種方法，試驗(yàn)結(jié)果表明，自來(lái)水沖洗是簡(jiǎn)便易行且較適合的化凍方式。

干燥法超低溫保存是貯藏小黑麥花粉的相對(duì)較為理想的保存方式，然而關(guān)于超低溫保存前后花粉生理生化變化和遺傳性狀穩(wěn)定性等機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究。

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