不同類型鹽脅迫對小黑麥種子萌發(fā)的影響

孟晨，魯雪莉，王菊英，魏云沖，張成省，李義強，徐宗昌*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所海洋農(nóng)業(yè)研究中心，山東 青島 266100；2. 國家鹽堿地綜合利用技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 東營 257345；3. 青島市濱海鹽堿地資源挖掘與生物育種重點實驗室，山東 青島 266100；4. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島 266109）

土壤鹽漬化是制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一，可造成離子毒害和滲透脅迫，嚴重影響植物的品質(zhì)與產(chǎn)量［1］。鹽漬土中含有的鹽類主要有氯化鈉、硫酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鎂等，在很大程度上限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，鹽堿地利用改良面臨巨大的挑戰(zhàn)。培育耐鹽植物品種是改良和利用鹽堿地的重要措施，植物的耐鹽性鑒定與評價尤為重要［2］。小黑麥（Triticale）是通過小麥（Triticum aestivum）和黑麥（Secale cereale）屬間雜交，應(yīng)用染色體工程育種技術(shù)人工培養(yǎng)的異源多倍體新物種，結(jié)合了小麥和黑麥的優(yōu)點，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、適應(yīng)性廣等雜種優(yōu)勢，具有改良鹽堿地的作用［3-4］。

種子萌發(fā)期是植物對環(huán)境脅迫最敏感的時期，直接影響植物的生長發(fā)育［5-7］。種子在萌發(fā)階段的耐鹽性在一定程度上反映了其耐鹽程度［8］。鹽脅迫會對植物產(chǎn)生滲透脅迫和離子毒害，進而限制植物的生長發(fā)育［9］。種子能否在鹽堿環(huán)境下發(fā)芽成苗是決定該植株在該環(huán)境下是否完成整個生長發(fā)育過程的關(guān)鍵［10］。因此，研究植物在萌發(fā)期的耐鹽性有著重要的意義。以往對小黑麥耐鹽性的研究多集中在NaCl 脅迫條件，耐鹽機制主要涉及植株發(fā)育、生理生化及分子等水平，也有少量Na2SO4和NaHCO3的研究報道，認為NaCl、Na2SO4和NaHCO3對植物毒性的差異可能是由于不同的陰、陽離子的作用機制不同導(dǎo)致的［3，11-12］。因此本研究利用不同濃度的NaCl，KCl，Na2SO4，MgSO4，NaHCO3單鹽及NaCl、Na2SO4和NaHCO3按照一定比例混合的混合鹽對小黑麥進行脅迫處理，以明確不同類型鹽脅迫對小黑麥種子萌發(fā)的影響，以期為利用小黑麥改良鹽堿地提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗小黑麥材料為晉飼草1 號，由東營農(nóng)高區(qū)鹽堿地試驗中心保存，2022 年夏收后用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃度設(shè)置 根據(jù)李鴻文等［11］的鹽脅迫試驗，對NaCl，KCl，Na2SO4，MgSO4，NaHCO3采用摩爾濃度，分別設(shè)置0（CK），10，25，50，100 和200 mmol·L-1共計5 個鹽濃度梯度?；旌消}（salts mixture）按照NaHCO3∶NaCl∶Na2SO4=1∶15∶84 配制［13］，設(shè)置0（CK），0.05%，0.15%，0.30%，0.60%和1.20%共計6 個鹽濃度。以上溶液均用蒸餾水配制。

1.2.2 萌發(fā)試驗 挑選籽粒飽滿、大小均一的小黑麥種子用自來水揉搓清洗3 次，去除表面灰塵和雜菌，然后使用10%的NaClO 溶液顛倒清洗數(shù)次，最后用無菌水沖洗3 次，得到表面無菌種子。在直徑為9 cm 的墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中加入5 mL 不同濃度的處理溶液，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，以蒸餾水作為對照處理。每個培養(yǎng)皿中放置30 粒小黑麥種子，從第3 天開始（生長的小黑麥芽高于培養(yǎng)皿）每天更換新培養(yǎng)液以保持處理濃度始終一致和保證足夠的水分供小黑麥生長。將培養(yǎng)皿放置在光周期為16 h 光照，8 h 黑暗，溫度（24±1） ℃，濕度60%的植物培養(yǎng)間進行培養(yǎng)［14］。

1.3 測定指標

以胚芽長于種子1/2 作為萌發(fā)標準，逐日統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)，以第3 天發(fā)芽種子數(shù)占種子總數(shù)的百分比作為發(fā)芽勢（germination energy， GE）［3］，第7 天時以發(fā)芽數(shù)占種子總數(shù)的百分比作為發(fā)芽率（germination rate， GR），并測量株高（seedlings length， SL）和根長（root length， RL）以及根數(shù)（roots number， RN，大于籽粒50%的須根作為有效根）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel、SPSS 17.0 等軟件進行平均值、方差、顯著性、主成分以及隸屬函數(shù)等多元分析。相關(guān)公式如下：

式中：GI為發(fā)芽指數(shù)（germination index）；DG為逐日發(fā)芽數(shù)（daily germination）；DT為相應(yīng)DG的發(fā)芽天數(shù)（germination days）；SVI為簡易活力指數(shù)（simple vigor index）；GR為發(fā)芽率；SL為株高；RSIR為相對鹽害率（relative salt injury rate， %）；CK1、CK2、CK3分別代表對照重復(fù)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 的發(fā)芽率；T1、T2、T3分別代表鹽處理重復(fù)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的發(fā)芽率。

式中：U表示隸屬函數(shù)值；Xij表示第i個種質(zhì)的第j個主成分分值；Xjmax表示第j個主成分的最大值；Xjmin表示第j個主成分的最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型和濃度鹽脅迫下小黑麥萌發(fā)特征分析

小黑麥種子萌發(fā)峰值時間在6 種鹽處理的低濃度條件下基本都是第2 天（圖1）；在NaCl 和KCl 處理下，除200 mmol·L-1處理組外，其他濃度處理組的萌發(fā)趨勢較為一致，較高濃度處理組的種子萌發(fā)數(shù)少；除NaCl 和KCl外，小黑麥種子在中高濃度鹽溶液處理組中的最大萌發(fā)峰值均有推遲現(xiàn)象，以Na2SO4、NaHCO3和混合鹽處理組的表現(xiàn)明顯。50 mmol·L-1NaHCO3對小黑麥種子的萌發(fā)表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，小黑麥種子的最大萌發(fā)峰值推遲，萌發(fā)粒數(shù)較少。在100 mmol·L-1的Na2SO4和NaHCO3處理下，小黑麥種子的最大萌發(fā)峰值推遲為第3 天，且NaHCO3處理組的萌發(fā)數(shù)低于Na2SO4處理組，小黑麥種子的萌發(fā)受到了顯著的抑制。

圖1 不同鹽處理下小黑麥的萌發(fā)曲線Fig.1 The germination curve of triticale under different salt treatments

2.2 不同類型鹽脅迫對小黑麥種子萌發(fā)指標的影響

隨著鹽處理濃度的升高，小黑麥的發(fā)芽率和發(fā)芽勢總體呈下降的趨勢（表1）；當KCl 處理濃度為200 mmol·L-1時，小黑麥種子的發(fā)芽勢較對照降低了90%，發(fā)芽率較對照降低了68.89%；當MgSO4處理濃度為200 mmol·L-1時，發(fā)芽勢較對照降低了43.33%，發(fā)芽率較對照降低了80%；在200 mmol·L-1的NaCl、Na2SO4和NaHCO3處理下，小黑麥種子不發(fā)芽，表明高濃度的鹽處理對小黑麥種子的萌發(fā)有顯著的抑制作用。在100 mmol·L-1NaHCO3處理條件下，小黑麥的發(fā)芽勢和發(fā)芽率與對照相比分別降低了48.33%和75.56%，在相同Na+濃度條件下，NaHCO3對小黑麥的抑制毒害作用較強；在50 和100 mmol·L-1處理濃度下，KCl 對小黑麥種子萌發(fā)率的影響小于NaCl，在200 mmol·L-1處理濃度下，KCl 對種子萌發(fā)率的影響最小；在混合鹽處理組濃度為0.60%和1.20%時，小黑麥種子的發(fā)芽勢與對照組相比有顯著降低，分別降低了8.33%和26.67%，混合鹽處理濃度為0.15%，0.30%，0.60%和1.20% 時，種子的發(fā)芽率與對照組相比有顯著差異，較對照組分別降低了6.67%，5.56%，8.89%和42.23%。

表1 不同類型鹽脅迫對小黑麥種子萌發(fā)指標的影響Table 1 Effect of different salt stresses on germination indicators of triticale seeds（%）

10 mmol·L-1NaCl 處理組相對鹽害率為0，對小黑麥生長沒有影響（表1）；200 mmol·L-1的NaCl、Na2SO4和NaHCO3處理組的相對鹽害率為100%，小黑麥不能存活，而200 mmol·L-1的KCl 和MgSO4處理組則有少量的小黑麥種子可以生長，與發(fā)芽率結(jié)果一致；低濃度鹽處理條件下（10～25 mmol·L-1），以相對鹽害率作為評價指標，小黑麥的耐受能力依次為NaCl，混合鹽，KCl， MgSO4， Na2SO4和NaHCO3；中濃度鹽處理條件下（50～100 mmol·L-1），小黑麥的耐受能力依次為KCl， NaCl，混合鹽，MgSO4，Na2SO4和NaHCO3。

2.3 不同類型和濃度鹽脅迫對小黑麥發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

隨著鹽濃度的增加，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈逐漸降低的趨勢（表2）。高濃度鹽脅迫對小黑麥種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)抑制作用顯著。NaCl 和KCl 處理濃度在100 mmol·L-1及以下，小黑麥種子的發(fā)芽指數(shù)與對照組無顯著差異；當NaCl 和KCl 處理濃度達到100 mmol·L-1時，小黑麥種子的活力指數(shù)與對照組差異顯著；當MgSO4處理濃度達到50 mmol·L-1時，處理組的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與對照組相比呈顯著差異；在25、50 及100 mmol·L-1Na2SO4處理條件下，種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與對照組相比均有顯著差異；10 mmol·L-1NaHCO3處理組的種子發(fā)芽指數(shù)與對照組相比有顯著差異，活力指數(shù)小于對照組，表明NaHCO3對小黑麥種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的抑制作用顯著，與發(fā)芽率和發(fā)芽勢趨勢一致?；旌消}處理組濃度達到0.60%和1.20%時，種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與對照組相比有明顯差異，與發(fā)芽率和發(fā)芽勢的趨勢一致。

表2 不同類型鹽脅迫對小黑麥種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Table 2 Effect of different salt treatment on seed germination index and vigor index

2.4 不同鹽脅迫對小黑麥幼苗株高和根發(fā)育的影響

小黑麥的株高隨著鹽濃度的增加總體呈逐漸降低的趨勢（圖2）。當Na2SO4、MgSO4和NaHCO3的濃度為100 mmol·L-1時，小黑麥幼苗株高降低為3.25，3.89 和1.91 cm，均在對照組的30.00% 以下。200 mmol·L-1NaHCO3處理組的小黑麥不能正常發(fā)芽，NaCl、KCl、Na2SO4和MgSO4的處理濃度為200 mmol·L-1時，小黑麥的株高分別為對照組的8.77%，18.98%，2.98%和12.56%，高濃度鹽處理顯著抑制小黑麥幼苗株高。NaCl 和KCl 處理對小黑麥株高的影響相對較小，10～50 mmol·L-1NaCl 處理組的株高分別為12.11，12.56 和11.48 cm，10 和25 mmol·L-1KCl 處理組的株高分別為12.18 和11.86 cm，均高于對照組，說明低濃度的NaCl 和KCl 對小黑麥的株高有一定的促生作用，但差異不顯著；混合鹽表現(xiàn)較為均衡，除0.30%混合鹽處理組的株高略高于對照外，其他處理組株高均低于對照組，0.60%和1.20%混合鹽處理組的株高與對照組相比有顯著差異，分別為對照組株高的56.01%和49.42%。

圖2 鹽脅迫下小黑麥的株高、根長及須根數(shù)目Fig. 2 Seedling length， root length and fiber root number of triticale under salt stress

小黑麥的根長也隨著鹽處理濃度的增加呈逐漸降低的趨勢（圖2）。當KCl、Na2SO4、MgSO4和NaHCO3的處理濃度為10 mmol·L-1時，小黑麥的根長被顯著抑制，分別為對照組的52.69%，49.50%，41.76%和50.49%。10 和25 mmol·L-1NaCl 處理組的根長與對照組沒有顯著差異，在NaCl 處理濃度為50～200 mmol·L-1時，對小黑麥根長的抑制作用明顯，處理組小黑麥的根長分別為對照組的59.60%，55.20%和21.56%。200 mmol·L-1的MgSO4和100、200 mmol·L-1的NaHCO3脅迫處理下小黑麥不長根。 200 mmol·L-1的NaCl，KCl 和Na2SO4、MgSO4處理組中小黑麥的須根數(shù)比對照組顯著減低，其余處理組對須根數(shù)目影響不大。

2.5 主成分分析

對小黑麥的7 個指標進行主成分分析，以特征值大于1 為標準，除混合鹽處理提取出2 個主成分外，其余處理組都只提取到1 個主成分（表3）。NaCl 處理下主成分貢獻率為94.931%，在發(fā)芽率上有最大載荷，反映的是萌發(fā)。KCl 的主成分貢獻率為85.787%，在發(fā)芽指數(shù)上有最大載荷，反映的是種子活力。Na2SO4的主成分貢獻率為90.013%，簡易活力指數(shù)占最大載荷，反映的是種子活力。MgSO4的主成分貢獻率為90.290%，在須根數(shù)目上有最大載荷，反映的是根系發(fā)育。NaHCO3的主成分貢獻率為94.765%，在發(fā)芽率上有最大載荷，反映的是種子萌發(fā)。混合鹽處理的第1 主成分貢獻率為78.149%，其在發(fā)芽指數(shù)上有最大載荷，反映的是種子活力；第2 主成分貢獻率為17.521%，其在須根數(shù)目上有最大載荷，反映的是根系生長。

表3 耐鹽性指標的主成分分析Table 3 Principal component analysis of salt tolerance evaluation indexes

2.6 隸屬函數(shù)綜合分析

模糊隸屬函數(shù)法可綜合各耐鹽性指標，依據(jù)其隸屬函數(shù)值排序綜合評價鹽脅迫下小黑麥的耐鹽性，可避免單一指標評價所帶來的片面性從而更加客觀真實。排序結(jié)果顯示（表4），CK 最好，其次是25 mmol·L-1NaCl，未鑒定到促生鹽類和濃度，各類型鹽和濃度對小黑麥的生長均有抑制作用。在低濃度鹽處理（10、25 mmol·L-1）條件下，小黑麥對不同類型鹽的耐力排序為：NaCl＞KCl＞MgSO4＞Na2SO4＞NaHCO3，在中濃度鹽處理（50、100 mmol·L-1）條件下，小黑麥對不同類型鹽的耐受能力為NaCl＞KCl＞Na2SO4＞MgSO4＞NaHCO3，在200 mmol·L-1處理條件下，小黑麥對不同類型鹽的耐受能力為KCl＞MgSO4＞NaCl＞Na2SO4＞NaHCO3，小黑麥對混合鹽處理的耐受能力排序為0.30%＞0.05%＞0.15%＞0.60%＞1.20%。

表4 隸屬函數(shù)值及耐鹽性綜合評價Table 4 Subjection values and comprehensive evaluation of salt tolerance of triticale under different salt treatments

3 討論

目前對作物耐鹽評價及鑒定工作主要集中于水稻（Oryza sativa）［15-17］、小麥［18-19］、玉米（Zea mays）［20］和大豆（Glycine max）［21］等作物，且多為單一NaCl 處理。本研究除了分析NaCl 脅迫外，增加了KCl、Na2SO4、MgSO4和NaHCO3脅迫處理以及NaCl、Na2SO4和NaHCO3混合鹽脅迫，有利于更全面地分析評價小黑麥的耐鹽性。鹽脅迫對于作物不同發(fā)育時期的影響不同，且不同發(fā)育階段的耐鹽性沒有直接相關(guān)性［14］。種子萌發(fā)及幼苗生長是植物生長發(fā)育及適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)，同時也是鹽脅迫下最為敏感極易遭受危害的階段。處于鹽脅迫下的種子常表現(xiàn)出發(fā)芽率降低、活力下降、生長受抑制等現(xiàn)象，嚴重時種子甚至不能萌發(fā)。種子萌發(fā)期對不同鹽的反應(yīng)往往最能體現(xiàn)該植物對不同鹽處理的耐受性。

本研究使用不同濃度的NaCl、KCl、Na2SO4、MgSO4和NaHCO3對小黑麥種子萌發(fā)階段進行脅迫。結(jié)果表明，隨著Na2SO4、MgSO4和NaHCO3鹽溶液濃度的增加，小黑麥種子的最大萌發(fā)峰值有延遲現(xiàn)象。鹽脅迫下的小黑麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢都要低于對照，且在不同鹽處理下隨著濃度的升高表現(xiàn)出不同程度的降低。高濃度鹽處理對小黑麥種子萌發(fā)抑制作用顯著，與郭文婷等［22］對一年生草本植物霧冰藜（Bassia dasyphylla）、刺沙蓬（Salsola ruthenica）和白莖鹽生草（Halogeton arachnoideus）的鈉鹽脅迫結(jié)果一致，推測可能是由于處理液中含有大量的離子，抑制了種子中代謝相關(guān)酶活性，細胞代謝紊亂，抑制種子萌發(fā)，或是由于較高的離子濃度增加了種子滲透勢，導(dǎo)致質(zhì)壁分離，影響種子的吸脹，從而使種子萌發(fā)力下降。值得注意的是，在相同濃度處理條件下，NaHCO3對小黑麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的抑制作用最明顯，可能與其較高的pH 有關(guān)。試驗結(jié)果顯示，5 種單鹽脅迫處理對小黑麥種子萌發(fā)的抑制作用為NaHCO3＞Na2SO4＞MgSO4＞NaCl＞KCl，與李玉梅等［23］和吉小敏等［24］分別在肥皂草（Saponaria officinalis）種子、鹽樺（Belula halophila）種子萌發(fā)中NaHCO3抑制作用最顯著，Na2SO4比NaCl 的抑制作用更大的結(jié)果一致。本研究推測可能是堿性鹽的高pH 對小黑麥種子的萌發(fā)抑制作用要大于中性鹽，而由于相同濃度處理條件下，Na2SO4鹽溶液中含有的Na+濃度高于NaCl，對種子產(chǎn)生的離子毒害更強，從而對小黑麥的萌發(fā)產(chǎn)生了更明顯的抑制作用，這也與黃立華等［25］的觀點一致。

不同種類和不同濃度的鹽脅迫對小黑麥幼苗的生長也表現(xiàn)出不同程度的影響。測定處理7 d 的小黑麥幼苗株高和根長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度的NaCl 和KCl 對小黑麥幼苗株高有一定的促進作用。在中高濃度條件下，5 種鹽處理對小黑麥幼苗株高和根長的抑制作用明顯，其中NaHCO3的作用最顯著。以上結(jié)果可能是由于NaHCO3作為一種堿性鹽，不僅通過滲透作用和離子毒害抑制小黑麥種子萌發(fā)和幼苗生長，還造成了較高pH 的影響。堿性環(huán)境下，細胞為了維持正常的生命活動，需要消耗更多的物質(zhì)和能量去對抗pH 過高的逆境，進而生長受到抑制［26-27］。

植物耐鹽性是由多種因素間的交互影響及協(xié)同作用而決定，因此本研究同時利用相對鹽害率、主成分分析和隸屬函數(shù)法等分析小黑麥在不同鹽處理下的耐鹽性。主成分分析表明，評價小黑麥耐鹽性的主要指標為發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及根長，與現(xiàn)有研究報道有一定的相似性。陳新等［28］研究發(fā)現(xiàn)與裸燕麥（Avena nuda）萌發(fā)期耐鹽性關(guān)系密切的指標為發(fā)芽勢和發(fā)芽率。謝楠等［29］認為存活率、株高及地上生物量等與小黑麥的耐鹽性顯著相關(guān)。此外，隸屬函數(shù)值排序表明，小黑麥對混合鹽處理的耐受度相對較高，對NaHCO3的耐受度最低，在中低濃度（10～100 mmol·L-1）鹽處理下，小黑麥對Cl-鹽類的耐受力高于SO42-鹽類，而在高濃度處理條件下，小黑麥對含有Na+的鹽處理耐受能力較差。以上研究結(jié)果為小黑麥的耐鹽評價鑒定提供了重要依據(jù)。

4 結(jié)論

在單鹽脅迫及混合鹽脅迫下，小黑麥種子的萌發(fā)及幼苗生長都受到了抑制。同等濃度下，NaHCO3對小黑麥種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用最強。篩選出了發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和根長是對小黑麥進行耐鹽性評價及鑒定的重要指標，在同等試驗條件下可以作為小黑麥萌發(fā)期耐鹽性鑒定的評價及篩選指標。