敲低膜聯(lián)蛋白A7對胃癌細(xì)胞MGC-803增殖的影響*

吳雪艷，田煥娜，王小杰（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

敲低膜聯(lián)蛋白A7對胃癌細(xì)胞MGC-803增殖的影響*

吳雪艷，田煥娜△，王小杰
（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，靶向敲低人胃癌MGC-803細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A7（Annexin A7，ANXA7）的表達(dá)，觀察ANXA7低表達(dá)對MGC-803細(xì)胞增殖的影響。方法：實(shí)驗分為3組，以靶向ANXA7的siRNA轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞為siRNA干擾組，另設(shè)陰性對照組和空白對照組，以Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后MGC-803細(xì)胞ANXA7的表達(dá)，應(yīng)用MTT法、克隆形成實(shí)驗檢測ANXA7低表達(dá)對MGC-803細(xì)胞的增殖能力的影響。結(jié)果：siRNA干擾組細(xì)胞ANXA7的表達(dá)較陰性對照組和空白對照組明顯降低（P＜0.05）。敲低ANXA7表達(dá)后，MGC-803細(xì)胞的增殖活性和克隆形成能力明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：ANXA7低表達(dá)可抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖。

ANXA7；MGC-803；增殖

膜聯(lián)蛋白A7（Annexin A7，ANXA7）是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族成員［1］。在生物學(xué)特性上，ANXA7參與細(xì)胞的多項生物學(xué)行為，包括細(xì)胞的生長、分化、增殖、運(yùn)動、分泌、凋亡等環(huán)節(jié)［2］。多種腫瘤組織ANXA7的表達(dá)發(fā)生了改變，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［3-4］。胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)，ANXA7表達(dá)與胃癌的發(fā)生、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)［5］。因此，ANXA7有望成為胃癌分化、轉(zhuǎn)移的判斷指標(biāo)，有必要對其功能進(jìn)行深入研究。本研究采用RNA干擾技術(shù)敲低胃癌細(xì)胞株MGC-803細(xì)胞ANXA7的表達(dá)，觀察ANXA7低表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，探討ANXA7成為胃癌治療潛在分子靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材 料 MGC-803細(xì) 胞，上海中科院 細(xì) 胞庫。β-actin鼠抗單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；ANXA7鼠抗單克隆抗體、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、siRNA試劑、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，美國Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗分組 胃癌MGC-803細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM中，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞種植于6孔板中，使細(xì)胞在24h內(nèi)達(dá)到40%-60%的密度；按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6h更換含血清培養(yǎng)基。其中轉(zhuǎn)染靶向ANXA7 siRNA的細(xì)胞為siRNA干擾組、轉(zhuǎn)染陰性siRNA的細(xì)胞為陰性對照組，空白對照組不做處理。

1.3 Western blot 檢測ANXA7的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；Western blot法檢測ANXA7的表達(dá)，一抗為ANXA7鼠抗人單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，ECL檢測。以檢測相應(yīng)細(xì)胞β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參照。應(yīng)用Quantity One V4.52軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度比值作為ANXA7蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4 MTT實(shí)驗 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h消化細(xì)胞，按2000細(xì)胞/每孔接種于96孔板，分別檢測24h、48h、72h和96h細(xì)胞的增殖活性。每孔加入10?l MTT，37℃孵育4h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入150?l DMSO溶解結(jié)晶物，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上震蕩10min，酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490nm處

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測siRNA沉默ANXN7的效果 轉(zhuǎn)染后48h，Western blot檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，siRNA干擾組細(xì)胞ANXN7蛋白的表達(dá)明顯下降（圖1）。結(jié)果顯示siRNA能有效敲低MGC-803細(xì)胞ANXA7的表達(dá)。檢測OD值，每次設(shè)6個重復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗 胰酶消化處于對數(shù)期生長的各組細(xì)胞，分別接種于6孔板中（500個細(xì)胞/孔），加入2ml DMEM培養(yǎng)液，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)液，PBS小心浸洗2次，4%多聚甲醛固定30min，姬姆薩染液染色10min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥；肉眼計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)并進(jìn)行分析；每組細(xì)胞設(shè)3個平行對照孔。

圖1 Western blot檢測MGC-803細(xì)胞ANXA7的表達(dá)

2.2 ANXA7低表達(dá)對MGC-803細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果見圖2。與陰性對照組和空白對照組相比，siRNA干擾組MGC-803細(xì)胞的增殖活性明顯降低（P ＜0.05），陰性對照組和空白對照組MGC-803細(xì)胞增殖活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 ANXA7低表達(dá)對MGC-803細(xì)胞增殖的影響

2.3 ANXA7低表達(dá)對MGC-803細(xì)胞克隆形成的影響

siRNA干擾組細(xì)胞克隆數(shù)為（190±14），陰性對照組細(xì)胞克隆數(shù)為（370±18），空白對照組細(xì)胞克隆數(shù)為（352±23）。與陰性對照組和空白對照組比較，siRNA干擾組細(xì)胞克隆數(shù)明顯降低（P＜0.05）。提示，ANXA7低表達(dá)的MGC-803細(xì)胞克隆形成能力下降。

3 討論

胃癌是全球第二大惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于肺癌，世界范圍內(nèi)5年死亡率超過80%。據(jù)國際癌癥研究中心分析統(tǒng)計，全球每年有近100萬胃癌新發(fā)病例，有明顯的流行病學(xué)特征和地理差異，而我國為高發(fā)地區(qū)。在臨床上，即使是根治性切除術(shù)，胃癌5年內(nèi)復(fù)發(fā)率仍高達(dá)60%-70%，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為提高胃癌患者生存率的主要障礙［6］。目前，已發(fā)現(xiàn)許多與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，其中ANXA7與胃癌關(guān)系密切［5］。

ANXA7是膜聯(lián)蛋白家族成員，該家族具有典型的磷脂結(jié)合特性、Ca2+通道形成特性，在膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分化、凋亡、生長調(diào)節(jié)及鈣離子信號途徑等方面發(fā)揮廣泛的生物學(xué)功能。并且，ANXA7能夠促進(jìn)膜的聚集、黏著、融合、運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。

研究顯示，ANXA7是原癌基因Ras調(diào)節(jié)通路的組成部分，ANXA7低表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力［7-8］。本研究觀察了siRNA干擾ANXA7表達(dá)后對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA干擾組MGC-803細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力均明顯降低。本研究結(jié)果表明，ANXA7低表達(dá)能夠降低MGC-803細(xì)胞的增殖能力，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

［1］Creutz CE， Pazoles CJ， Pollard HB. Identif ication and purif ication of an adrenal medullary protein （synexin） that causes calciumdependent aggregation of isolated chromaff in granules［J］. J Biol Chem， 1978， 253（8）： 2858-2866.

［2］Jia L， Wang S， Cao J， et al. siRNA targeted against matrix metalloproteinase 11 inhibits the metastatic capability of murine hepatocarcinoma cell Hca-Fto lymph nodes［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2007， 39 （11）： 2049-2062.

［3］Srivastava M， Bubendorf L， Raffeld M， et al. Prognostic impact of ANX7-GTPase in metastatic and HER2-negative breast cancer patients［J］. Clin Cancer Res， 2004， 10（7）： 2344-2350.

［4］Yadav AK， Renfrow JJ， Scholtens DM， et al. Monosomy of chromosome 10 associated with dysregulation of epidermal growth factor signaling in glioblastomas［J］. JAMA， 2009， 302（3）：276-289.

［5］奚劍敏，趙強(qiáng).AnnexinA7表達(dá)與胃癌分化和轉(zhuǎn)移關(guān)系研究［J］.臨床和實(shí)驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，9（10）：726-727.

［6］Takeuchi H， Ueda M， Oyama T， et al. Molecular diagnosis and translymphatic chemotherapy targeting sentinel lymph nodes of patients with early gastrointestinal cancers［J］. Digestion， 2010，82（3）： 187-191.

［7］Ji H， Moritz RL， Kim YS， et al. Analysis of Ras-induced oncogenic transformation of NIH-3T3 cells using differentialdisplay 2-DE proteomics［J］. Electrophoresis， 2007， 28（12）：1997-2008.

［8］Huang Y， Wang Q， Du Y， et al. Inhibition of annexin A7 gene and protein induces the apotosis and decreases the invasion， migration of the hepatocarcinoma cell line［J］. Biomed Pharmacother， 2014，68（7）： 819-824.

EFFECTS OF AXNXA7 KNOCKDOWN ON PROLIFERATION OF GASTRIC CARCINOMA MGC-803 CELLS

WU Xue-yan， TIAN Huan-na， WANG Xiao-jie

（Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective：To investigate low expression of Annexin A7 （ANXA7） on proliferation of gastric cancer MGC-803 cells by target-silencing ANXA7 expression using RNA interference technique.Methods：MGC-803 cells were grouped into siRNA interference group， negative control group and blank control group. RNA interference technology was used to transfect the siRNA targeted ANXA7 into MGC-803 cells to knock down expression of ANXA7. Western blot was used to detect the expression of ANXA7 after transfection； MMT assay and clone formation assay to detect the effects of low expression of ANXA7 on proliferation of MGC-803 cells. Results：The expression of ANXA7 in MGC-803 cells of siRNA interference group were obviously lower than negative control group and blank control group （P＜0.05）. The proliferationactivity and colony forming ability of MGC-803 cells declined after knocking down expression of ANXA7 （P＜0.05）. Conclusions：Low expression of ANXA7 can inhibit proliferation of gastric cancer MGC-803 cells.

Annexin A7 （ANXA7）； Gastric cancer MGC-803 cell； Proliferation

R735.2

A

1004-6879（2015）02-0095-03

2014-10-10）

*河北省高校省級重點(diǎn)學(xué)科“病理生理學(xué)”建設(shè)項目資助