活性污泥中氧化鐵細(xì)菌的分離鑒定及酶活的初步研究

汪令翔,張翔宇,朱秀玲,朱翠萍,孔 芳(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

活性污泥中氧化鐵細(xì)菌的分離鑒定及酶活的初步研究

汪令翔,張翔宇,朱秀玲,朱翠萍,孔 芳?
(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

利用尿素培養(yǎng)基富集培養(yǎng)及CGY平板劃線法,從污水處理廠采集的活性污泥中分離篩選得到一系列產(chǎn)氧化鐵酶菌株,結(jié)合Winogradsky液體培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵進(jìn)行產(chǎn)鐵氧化酶菌株的復(fù)篩,從中篩選產(chǎn)鐵氧化酶能力較高的目標(biāo)菌株.該菌株經(jīng)過菌落形態(tài)、鏡檢、生理生化試驗及16Sr DNA基因序列的遺傳分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立,被鑒定為Pseudomonas rhizosphaerae,命名為GS8.對該菌株產(chǎn)鐵氧化酶的酶活進(jìn)行測定,結(jié)果表明,該菌株是一株具有較高鐵氧化性的菌株,產(chǎn)鐵氧化酶的最適溫度和p H范圍分別為30℃和6.5～7.5, K＋與Mg2＋離子對鐵氧化酶活性有一定的激活作用,Pb2＋與Ag＋對鐵氧化酶活性有一定的抑制作用,而以Zn2＋對鐵氧化酶的抑制作用表現(xiàn)最強(qiáng).假單胞菌GS8菌株在治理污水與給排水工程中生物除鐵應(yīng)用具有潛在的應(yīng)用價值.

假單胞菌;鐵氧化酶;篩選;鑒定

由氧化鐵錳細(xì)菌產(chǎn)生的鐵、錳氧化酶系是污水處理最重要的酶系之一[1-4],其中使用較多的氧化鐵錳細(xì)菌包括浮游球衣菌屬(Sphaerotilus)、披毛菌屬(Gallionella)、纖發(fā)菌屬(Leptothrix)、鞘細(xì)菌(Sheathed bacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、聚球藻屬(Synechococcus)等[5-7],它們大多為化能自養(yǎng)菌,生長速率與代謝速率都很低,且產(chǎn)氧化酶系含量低,容易失活[8],因此,高效氧化鐵錳菌種的篩選及其氧化特性的深入研究,仍然是生物除鐵除錳技術(shù)開發(fā)利用的關(guān)鍵.假單胞菌屬的大多為化能異養(yǎng)型或兼性異養(yǎng)型細(xì)菌,能夠降解多種多樣的有機(jī)物,生長迅速、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng).據(jù)文獻(xiàn)報道,該屬的某些種屬具有氧化鐵的能力,可催化可溶性的Fe2＋氧化成Fe(OH)3,用于處理含鐵廢水,經(jīng)沉淀過濾從水中除去,達(dá)到凈化水質(zhì)的目的[9].從污水處理廠的活性污泥中就具有鐵氧化性細(xì)菌進(jìn)行快速篩選,對篩選的目的菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特征與分類學(xué)鑒定,并對其產(chǎn)鐵氧化酶條件進(jìn)行探討,為該菌應(yīng)用于污水生物除鐵提供了參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生活污水混合液2份,活性污泥混合液2份,取自安徽蕪湖污水處理廠.

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基.尿素培養(yǎng)基(g·L－1):尿素0.5,葡萄糖1.0,MgSO4·7H2O 0.05,K2HPO40.1,p H自然.

分離純化培養(yǎng)基.Stoke培養(yǎng)基(g·L－1):葡萄糖1.0,蛋白胨1.0,MgSO4·7 H2O 0.2,CaCl20.05, FeCl30.01,p H 7.0,瓊脂20;CGY分離純化培養(yǎng)基(g·L－1):蛋白胨5.0,酵母膏1.0,甘油10.0,p H 7.0,瓊脂20.

初篩培養(yǎng)基.Winogradsky鐵細(xì)菌培養(yǎng)基(g·L－1):NH4NO30.5,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,Na NO30.5,CaCl2·6 H2O 0.2,檸檬酸鐵銨10.0,p H自然.

復(fù)篩培養(yǎng)基(基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基).Fe2＋培養(yǎng)基(g·L－1):(NH4)2SO40.5,K2HPO40.5,NaNO30.5, MgSO4·7H2O 0.5,CaCl2·6 H2O 0.1,檸檬酸鐵銨10.0,p H 7.0.

1.3 方法

(1)富集培養(yǎng)及菌株的分離純化.吸取0.5 m L污水水樣接種于4.5 m L尿素培養(yǎng)基中進(jìn)行富集,28℃靜置培養(yǎng),每隔24 h檢查液體培養(yǎng)基是否變渾濁,如有則更換到新鮮培養(yǎng)基中反復(fù)富集3～4次,然后再在Stoke固體平板中多次劃線純化,挑取分離出的單菌落接種于CGY培養(yǎng)基中保存.

(2)初篩與復(fù)篩.將在Stoke平板中分離純化的單菌落接到Winogradsky液體培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩, 28℃恒溫培養(yǎng),每隔12 h觀察培養(yǎng)基中是否有紅褐色沉淀產(chǎn)生,選擇沉淀時間短且沉淀程度好的菌株再進(jìn)行下一輪的復(fù)篩.將初篩出的菌株接入CGY液體培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)3 d進(jìn)行活化,然后配制菌懸液濃度為106～107CFU/m L,以2%接種量接入50 m L基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩,28℃恒溫150 r/min震蕩培養(yǎng)3 d,將發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min,除棄菌體及不溶物,收集上清液以測定鐵氧化酶的活性.

(3)鐵氧化酶活力的測定.改良TMPD法[10],吸取粗酶液5 m L,加入FeSO4至200 mg/L,30℃靜置反應(yīng)30 min,將沉淀物去除,然后按鄰啡啉法進(jìn)行,在OD600時測定培養(yǎng)基中鐵氧化酶活性.

式中,OD平均值為3個平行測定值的均值;OD空白組為未接菌種的測定值.由于目前該酶酶活尚無明確規(guī)定,故本實驗中規(guī)定測量組中氧化率最高者的相對酶活為100%.鐵氧化酶活性是以該酶對Fe2＋的氧化率來表示,氧化率越高表明酶活性越高.

(4)菌株的培養(yǎng)特征及生理生化特征實驗.根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[11-12]對菌株生理生化進(jìn)行鑒定.

(5)16S r DNA基因序列的測定與進(jìn)化樹的構(gòu)建.采用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件為:96℃3 min;96℃30 sec,53℃45 sec,72℃1 min,循環(huán)30次;延伸10 min,擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,全序列的測定提交上海生工生物公司完成.

序列與NCBI網(wǎng)站GenBank中的已知序列進(jìn)行Blast.采用MAGE4.0軟件中Bootstrap Test of Phylogeny的N-J算法(BootStrap的設(shè)定值為1000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

(6)菌株產(chǎn)鐵氧化酶的酶學(xué)特性研究.接1.3(2)方法制備鐵氧化酶粗酶液,將發(fā)酵液于4℃離心10 min,收集上清液作為粗酶液備用.

①溫度對鐵氧化酶酶活的影響.收集5 m L上清液在不同溫度25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃下保持30 min,測定發(fā)酵液中的酶活.

②p H對鐵氧化酶酶活的影響.收集的上清液用HCL或NaOH將發(fā)酵液的p H分別調(diào)節(jié)為5.5、6、6.5、7、7.5、8.0、8.5,室溫保持30 min,測定發(fā)酵液的酶活.

③金屬離子對鐵氧化酶酶活的影響.收集5 m L上清液添加不同金屬離子溶液,取NaCl、KCl、MgCl2、ZnCl2、CuCl2、Pb NO3、Ag NO3溶液,調(diào)節(jié)金屬離子終濃度達(dá)到5 mmol/L,室溫保持30 min,測定發(fā)酵液的酶活.

2 結(jié)果與分析

2.1 富集與分離純化

通過尿素培養(yǎng)基的反復(fù)富集及Stoke平板多次劃線純化分離,成功從4份不同來源的樣品中純化分離出15株菌株.將15株菌株接種于Winogradsky液體培養(yǎng)基進(jìn)行初篩,由于Winogradsky液體培養(yǎng)基中含有檸檬酸鐵銨的成分,能產(chǎn)生鐵氧化酶的菌株可將Fe2＋氧化生成紅褐色的Fe(OH)3沉淀,然后根據(jù)沉淀出現(xiàn)的時間及沉淀變化的程度,定性判斷可產(chǎn)生鐵氧化酶的菌株,從而在15份菌株中篩選出GS1、GS3、GS6、GS7、GS8、GS11、GS12共7株菌株.

2.2 高效氧化鐵菌株的復(fù)篩

將初篩的7個菌株接種于復(fù)篩基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d,測定發(fā)酵液的鐵氧化率與相對酶活,結(jié)果如圖1所示.由圖1可知,以菌株對Fe2＋氧化率的大小作為菌株產(chǎn)鐵氧化酶活力高低的評價,不同菌株所產(chǎn)的鐵氧化酶酶活力有一定的差異,由高到低排列為GS8＞GS11＞GS1＞GS12＞GS7＞GS3＞GS6,其中,菌株GS8的鐵氧化率可達(dá)57.5%.設(shè)定鐵氧化率最高菌株GS8的相對酶活為100%,其余菌株酶活跟其比值表示各菌株的相對酶活,菌株GS8、GS11、GS1、GS12的相對酶活均達(dá)到60%,下面實驗選擇相對酶活最高的GS8菌株.

2.3 菌株GS8的初步鑒定

(1)菌株GS8菌落形態(tài)特征.菌株GS8在Stoke固體平板上培養(yǎng)2 d,形成白色隆起、無光澤、邊緣不規(guī)則的粗糙型菌落;在CGY固體平板上,形成隆起明顯增大菌苔厚實、淡黃色圓形突起、邊緣整齊的濕潤光滑型菌落;在Winogradsky鐵細(xì)菌培養(yǎng)基上形成圓型隆起、紅褐色帶金屬光澤的菌落,如圖2所示.由圖2d可知,細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢顯示單個細(xì)胞呈桿狀,該菌株為革蘭氏陰性菌,不產(chǎn)芽孢.

(2)菌株GS8液體培養(yǎng)特征.菌株GS8在CGY液體培養(yǎng)基中,靜止培養(yǎng)24 h開始形成菌膜,72 h后菌膜增厚,搖動不易破裂;在Winogradsky液體培養(yǎng)基中Fe2＋可被氧化生成紅褐色的Fe(OH)3沉淀,如圖3a、圖3b所示.

(3)生理生化特征.菌株GS8的生理生化反應(yīng)試驗結(jié)果如表1所示.由表1可知,該菌株可能會產(chǎn)生硝酸鹽還原酶與過氧化氫酶,可被酒石酸鹽與檸檬酸鹽利用,并呈陽性反應(yīng);在Winogradsky固體平板上形成紅褐色金屬光澤的菌落,這與該菌株體內(nèi)存在較強(qiáng)的鐵氧化酶系有關(guān);甲基紅反應(yīng)為陽性;菌株有微弱的明膠液化能力;V.P測定為陰性反應(yīng);可分解葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸但不產(chǎn)氣.

表1 菌株GS8的生理生化反應(yīng)

(4)菌株GS8遺傳進(jìn)化樹的分析.以菌株GS8基因組DNA為模板進(jìn)行菌株16Sr DNA PCR擴(kuò)增, PCR電泳圖如圖4所示.將產(chǎn)物提交給上海生工測定序列全長,得知該擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 535 bp,將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株序列與假單胞菌屬的菌種同源性很高,如Pseudomonas rhizosphaerae、蒙氏假單胞菌(Pseudomonas monteilii)、陰城假單胞菌(Pseudomonas umsongensis)等的16Sr DNA基因序列具有高度同源性.按相似度高低選取相關(guān)的假單胞菌屬菌株18株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示.用MEGA4軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,其中菌株GS8與Pseudomonas rhizosphaerae(Genebank登錄號為AY152673)聚類并在同一分支, BLAST比對1535bp長度上二者同源性為99%,結(jié)合形態(tài)和培養(yǎng)特征、生理生化特征方面,菌株GS8可鑒定為假單胞菌屬,并且與Pseudomonas rhizosphaerae具有高度相似性.

2.4 菌株GS8產(chǎn)鐵氧化酶的酶學(xué)特性

(1)溫度對酶活力的影響.將酶液在不同溫度下保溫,鐵氧化酶的活力如圖6所示.由圖6可知,菌株GS8對溫度變化較為敏感,在溫度變化不太明顯條件下,酶活力變化較大.產(chǎn)鐵氧化酶的活性隨著溫度的升高呈先增后陡降的趨勢,產(chǎn)酶最適溫度為30℃.當(dāng)鐵氧化酶在溫度30℃時處理30 min,其氧化率仍可達(dá)54.6%,當(dāng)溫度在55℃時氧化率只有10.5%,可見高溫對酶活力的影響較為顯著.

(2)p H對酶活力的影響.設(shè)置p H為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,p H對鐵氧化酶的影響如圖7所示.由圖7可知,菌株GS8的鐵氧化酶的活性隨p H從偏酸到偏堿呈先升后降的趨勢,鐵氧化酶的穩(wěn)定p H范圍是偏中性的6.5～7.5,鐵氧化酶在p H 7.0時放置30 min,其氧化率仍可達(dá)52.4%.

(3)金屬離子對產(chǎn)酶的影響.金屬離子對鐵氧化酶的影響如圖8所示.由圖8可知,不同金屬離子對菌株GS8產(chǎn)鐵氧化酶的活性影響差異較大,以不加任何金屬離子的酶液相對酶活為100%作對照,其中對鐵氧化酶活性激活作用最好的為K＋與Mg2＋,這兩種離子的相對酶活和相對CK均約有118%以上,并且其鐵氧化率分別是52.2%與50%,均比空白對照(CK)42.5%高;其次是Na2＋也有較好的激活作用,相對酶活為105%,鐵氧化率達(dá)44.8%;Cu2＋的影響不明顯,相對酶活為95%,作用與CK相當(dāng);Pb2＋與Ag＋對鐵氧化酶活性有一定的抑制作用,而以Zn2＋對鐵氧化酶的抑制作用最強(qiáng).

3 結(jié)論

Fe2＋氧化酶是氧化鐵離子的主要活性因子,是微生物細(xì)菌在污水處理中的主要酶系,對菌株最適產(chǎn)酶條件的研究結(jié)果對該酶在給排水工程中的應(yīng)用具有一定的參考價值.從蕪湖污水處理廠的樣品中分離篩選得到一株具有較強(qiáng)鐵氧化活性的菌株GS8,對該菌株進(jìn)行分類學(xué)鑒定,確定該菌株屬于假單胞菌屬(Pseudomonas),并且與Pseudomonas rhizosphaerae具有高度相似性.由于在對菌種GS8的純化分離過程中,可能污水中存在球衣菌屬(Sphaerotilus)氧化鐵鞘細(xì)菌(sheathed bacteria),導(dǎo)致在前期富集培養(yǎng)篩選的GS8菌株中可能仍有較少鞘細(xì)菌的干擾.

培養(yǎng)條件對菌株GS8產(chǎn)生鐵氧化酶有較大的影響,該菌株所產(chǎn)鐵氧化酶的最適溫度和p H范圍分別為30℃和6.5～7.5,K＋與Mg2＋離子對鐵氧化酶活性有一定的激活作用,而Zn2＋對該菌株的鐵氧化酶的酶活性具有強(qiáng)抑制作用.假單胞菌GS8的鑒定以及產(chǎn)鐵氧化酶的最適溫度、最適p H值、金屬離子穩(wěn)定性的研究,對酶的分離純化與活性保護(hù)具有一定的指導(dǎo)意義.

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Study on the isolation and enzyme characteristic of iron-oxidizing bacterium from activated sludge

WANG Ling-xiang,ZHANG Xiang-yu,ZHU Xiu-ling,ZHU Cui-ping,KONG Fang?
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

A series of Ferro-oxidase producing strains were screened from the activated sludges by enrichment cultures and CGY streak plate methods.The strain which could produce oxidizing enzyme with the highest activity was rapidly selected by Winogradsky liquid tube methods and flask methods.The strain was identified according to morphological features,physiological and biochemical analysis as well as 16Sr DNA gene sequence analysis.The strain identified as Pseudomonas rhizosphaerae was named GS8.The strain has a potential application in sewage treatment.The optimum temperature and p H value range of Ferro-oxidase were 30℃and 6.5～7.5 respectively.K＋and Mg2＋could activate Ferrooxidase, whereas Pb2＋and Ag＋had only modest inhibitory effect,While Zn2＋could strongly inhibit Ferro-Oxidase.Strain GS8 has a potential application potential in sewage treatment.

Pseudomonas;Ferro-oxidase;screening;sewage treatment

X172

A

1672-2477(2015)05-0013-06

2015-09-18

國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃基金資助項目(201410363067);安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃基金資助項目(AH201410363067)

汪令翔(1992-),男,安徽潛山人,本科.

孔 芳(1973-),女,湖北隨州人,副教授,博士.

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