小麥條銹菌hsp70基因的克隆及熱脅迫下的表達特征分析

曹華寧, 劉 博, 劉太國, 高 利, 陳萬權(quán)

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

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小麥條銹菌hsp70基因的克隆及熱脅迫下的表達特征分析

曹華寧, 劉 博*, 劉太國, 高 利, 陳萬權(quán)*

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

為明確熱激蛋白70在小麥條銹菌對高溫適應性中的作用,采用RACE和PCR技術(shù)擴增得到小麥條銹菌hsp70的基因全長,并利用實時熒光定量PCR技術(shù)對熱脅迫下不同溫度敏感類型小麥條銹菌中hsp70的表達特征進行分析?？寺〉玫降男←湕l銹菌hsp70基因組序列全長為2 817 bp,包含7個內(nèi)含子,cDNA序列全長為2 267 bp,其中開放閱讀框為1 917 bp,編碼639個氨基酸,分子量為66.7 ku,等電點為5.15。編碼蛋白含3個保守的HSP70氨基酸序列。qRT-PCR試驗結(jié)果表明,28 ℃熱激后,hsp70的轉(zhuǎn)錄水平隨熱激時間的延長而略有增加,2 h達到最高值。不同溫度敏感類型菌株在熱激2 h后hsp70的相對表達量具有顯著差異。低敏感類型菌株hsp70平均表達量為未經(jīng)處理對照的7.12倍,而高敏感類型菌株hsp70平均表達量僅為對照的1.63倍。

小麥條銹菌; 溫度敏感類型; 熱激蛋白70; 克隆; 熒光定量PCR

小麥條銹病是由條形柄銹菌小麥?；?PucciniastriiformisWestend. f.sp.triticiEriks.,Pst)引起的世界范圍內(nèi)小麥生產(chǎn)上危害最為嚴重的一種病害,已成為影響小麥生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的限制因素[1-2]。相比其他植物病原真菌,甚至同屬的小麥稈銹菌和小麥葉銹菌,小麥條銹菌生長、繁殖與侵染活動均需要較低的溫度[3-4],在冷涼潮濕的地區(qū)發(fā)病嚴重,是一種典型的低溫病害。但近年來,不斷有研究發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌對溫度的適應性有所增強[5-7]。Milus等在兩種不同溫度條件下(日均溫14 ℃和20 ℃)對北美2000年前、后采集的條銹菌進行侵染力測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在低溫還是高溫條件下,2000年之后的條銹菌對高溫有更強的適應性,具體表現(xiàn)為潛伏期更短、侵染面積擴展更快、產(chǎn)孢量更大。推測這些2000年之后的條銹菌可能在小麥生長季節(jié)中持續(xù)侵染時間更長,從而造成更嚴重的損失[5-6]。Mboup等結(jié)合室內(nèi)試驗與田間調(diào)查對采自法國南部及北部的小麥條銹菌進行了研究,結(jié)果表明與北部菌株相比,南部菌株對溫暖的地中海氣候表現(xiàn)出更強的適應性[7]。陳萬權(quán)等在對云南、隴南等地的常年越夏調(diào)查中發(fā)現(xiàn),小麥條銹菌在部分地區(qū)的越夏海拔已經(jīng)發(fā)生50～300 m不同程度的下降[8]。王新俊等在對甘肅省平?jīng)鍪性较木捶植紖^(qū)域精準勘測的研究中發(fā)現(xiàn),夏季最熱一旬旬均溫 23～25 ℃的年份也可以查到小麥條銹菌的越夏菌源[9]。同樣,全輝等發(fā)現(xiàn)在河南省淅川縣低海拔地區(qū)(194～197 m近丹江水庫邊麥田),7-8月平均溫度在24.8 ℃時條銹病菌也能正常越夏和快速繁殖傳播[10]。肖志強等結(jié)合隴南50年來的氣象數(shù)據(jù)對當?shù)匦←湕l銹病的流行進行了分析,指出隴南山區(qū)近10年小麥條銹病流行程度逐年加重趨勢與冬季顯著的增暖趨勢相一致,與1990s以前相比,條銹病越冬越夏高界明顯提高了100～300 m,致使小麥條銹病危害范圍擴大,發(fā)生時間提前[11]。以上各項研究結(jié)果均表明,小麥條銹菌群體對溫度的適應性隨著氣候的變化在發(fā)生相應的調(diào)整,發(fā)病范圍正在擴大,流行頻率和嚴重度也在增加,推測其對溫度的忍耐能力在全球氣候變暖的環(huán)境下有所增強。

本研究組在2011年對來自西北、華北、長江中下游以及西南麥區(qū)不同年代(1980s、1990s、2000s、2010s)的126份小麥條銹菌樣本的單孢堆分離菌株的溫度敏感性進行了研究[8]。以病害抑制中溫度(ET50)為標準將所有菌株劃分為溫度低敏感性、中敏感性和高敏感性3個類群。結(jié)果表明,自然條件下不同麥區(qū)小麥條銹菌群體對溫度的耐受能力有所不同,總體趨勢是越溫暖的地區(qū)條銹菌群體對高溫的耐受能力越強,海拔、緯度越低地區(qū)的小麥條銹菌群體ET50值越高,反之越低,不同年代的條銹菌株隨著時間的推移耐高溫能力增強。對3類溫度敏感型代表菌株的寄生適合度測定結(jié)果表明：在14 ℃和22 ℃條件下,溫度低敏感型菌株的寄生適合度都要高于其他兩類,具體表現(xiàn)在潛育期短,擴展速度快,產(chǎn)孢量高等方面。說明溫度低敏感型菌株的生長與繁殖能力高于其他類型菌株。

熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs)作為一類對體內(nèi)外環(huán)境變化極為敏感的有機分子廣泛參與各種生理代謝途徑,是受高溫、病原體及其他理化因素等刺激后所產(chǎn)生的一組在生物進化中高度保守的蛋白[12]。根據(jù)分子量的不同,HSPs可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子量熱激蛋白(small HSP)。HSP70家族在正常細胞中水平較低,而在脅迫條件下可顯著升高,因此成為廣受關(guān)注,研究最為深入的一種熱激蛋白[13]。Montero-Barrientos等的研究表明,哈茨木霉菌 (Trichodermaharzianum)T34經(jīng)熱激后,hsp70基因表達量增加[14]。謝翎等通過實時熒光定量PCR檢測球孢白僵菌 (Beauveriabassiana)hsp70在高溫誘導下的表達量,結(jié)果表明高溫處理30 min時表達量最高,為對照的10.18倍,180 min時,表達量降到最低,為對照的2.85倍[15]。邢淑蓮研究了熱激后小麥白粉菌的hsp70表達量,發(fā)現(xiàn)28 ℃熱激60 min后,小麥白粉菌hsp70基因的相對表達量達到最高峰,為對照樣本的11.6 倍,隨后表達量下降,推測hsp70基因在小麥白粉菌耐高溫中有重要作用[16]。

本研究通過RACE技術(shù)對小麥條銹菌hsp70進行克隆、分析,并利用qRT-PCR分析了28 ℃熱激條件下溫度高、低敏感類型代表菌株hsp70的表達特征,表明不同溫度敏感類型的菌株在熱脅迫條件下hsp70的表達量存在差異,菌株的耐高溫特性與熱激蛋白的表達具有一定的關(guān)系。初步證實了HSP70在小麥條銹菌耐高溫機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

所有供試菌株信息見表1,菌株經(jīng)單孢堆分離純化、擴繁后由本實驗室保存。小麥條銹菌hsp70基因的克隆選用菌株11-6-4-1進行,qRT-PCR分析選取溫度低敏感類型(耐高溫菌株)及溫度高敏感類型(不耐高溫菌株)的代表菌株各3株進行。

表1 供試小麥條銹菌菌株

1.2 試劑

TRIzol試劑購自Invitrogen公司;SMARTer RACE cDNA Amplification Kit、Advantage 2 PCR Kit購自Clontech公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、LATaq購自TaKaRa公司;DNA膠回收試劑盒購自北京天根生物公司;pEASY-T3載體及感受態(tài)細胞購自全式金生物公司;UltraSYBR Mixture (With ROX)購自康為世紀生物科技公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 小麥條銹菌基因組DNA、總RNA的提取與cDNA合成

小麥條銹菌基因組DNA的提取方法參照Chen等[17]方法進行。采用TRIzol試劑提取新鮮以及各個處理條銹菌夏孢子的總RNA。cDNA第一鏈的合成參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行。RACE擴增參照SMARTer RACE試劑盒說明進行。

1.4 小麥條銹菌hsp70 cDNA序列及基因組DNA序列擴增

采用李翠翠[18]設(shè)計的真菌hsp70基因的簡并引物P1、P2(表2)擴增小麥條銹菌hsp70基因的核心片段。擴增反應體系(50 μL)為：10×TaqBuffer (Mg2+)2.5 μL、cDNA 2 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、10 μmol/L引物各 1 μL、Taq酶 (5 U /μL)0.25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,56 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。

根據(jù)得到的核心片段序列設(shè)計5′ RACE和3′ RACE引物(表2)。5′ RACE擴增反應體系(50 μL)：PCR-Grade Water 34.5 μL、10×Advantage 2 PCR Buffer 5.0 μL、dNTPs (10 mmol/L)1.0 μL、TaKaRa LATaq1.0 μL、5′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL、UPM 5 μL、5′ RACE引物 1 μL。3′ RACE擴增反應體系(50 μL)同5′ RACE體系,但其中cDNA為3′-RACE-Ready cDNA,引物為3′ RACE引物。RACE擴增touchdown PCR反應程序：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,5個循環(huán);94 ℃ 30 s,70 ℃ 3 s,72 ℃ 3 min,5個循環(huán);94 ℃ 30 s,68 ℃ 3 s,72 ℃ 3 min,27個循環(huán);72 ℃ 10 min。

根據(jù)獲得的hsp70 cDNA序列,設(shè)計引物ghsp70-S1、ghsp70-AS1、ghsp70-S2、ghsp70-AS2、ghsp70-S3、ghsp70-AS3(表2),以條銹菌基因組DNA為模板,對hsp70的基因組全長進行擴增。擴增反應體系(50 μL)：10×TaqBuffer (Mg2+)2.5 μL、DNA 2 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L 正反向引物各 1 μL、Taq酶 (5 U /μL)0.5 μL。第1對引物擴增程序為94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,36個循環(huán);72 ℃ 10 min。第2、3對引物擴增程序的退火溫度分別為58 ℃和56 ℃。

表2 小麥條銹菌hsp70克隆及熒光定量PCR分析所用引物序列1)

1) 簡并堿基H=ACT;R=AG;Y=CT;D=GAT;N=ATGC。

Degenerate bases H=ACT, R=AG, Y=CT, D=GAT and N=ATGC.

1.5 擴增產(chǎn)物的克隆與測序

hsp70 cDNA序列及基因組序列擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA膠回收試劑盒純化回收,克隆于pEASY-T3 載體上,經(jīng)轉(zhuǎn)化和藍白斑篩選后,由上海生工生物工程有限公司測序。

1.6 序列分析及同源性比較

利用ChromasPro對序列進行拼接和校對;采用NCBI的ORF finder預測開放閱讀框,BLAST進行序列同源性比對;使用ExPASY進行蛋白質(zhì)家族位點分析。

1.7 熱激條件下不同溫度敏感類型菌株hsp70基因表達特征分析

收集新鮮小麥條銹菌菌株11-6-4-1和10-9-1-9的夏孢子,分別等量放入各個冷凍管中,迅速轉(zhuǎn)至28 ℃水浴,分別熱激處理0 min、10 min、30 min、1 h、2 h、3 h,結(jié)束后用液氮迅速冷凍,提取樣品RNA。利用實時熒光定量PCR,以菌株熱激處理0 min的樣本分別為對照,分析熱激不同時間小麥條銹菌hsp70基因的表達特征。每個處理重復3次。

收集高、低溫度敏感類型代表菌株(表1)的新鮮夏孢子,分別等量放入各個凍存管中,迅速轉(zhuǎn)至28 ℃水浴中熱激處理2 h,結(jié)束后用液氮冷凍,提取樣品RNA。利用實時熒光定量PCR,以各個菌株熱激處理0 min的樣本分別為其對照,分析不同溫度敏感類型菌株hsp70基因的表達特征。每處理重復3次。

根據(jù)小麥條銹菌hsp70的cDNA序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計qRT-PCR特異引物(表2)。選用小麥條銹菌Actin基因作為內(nèi)參[19],以各個樣本的cDNA為模板,進行PCR擴增。反應體系為：2×UltraSYBR Mixture 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA 2 μL,補超純水至20 μL。擴增程序為：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,45個循環(huán)。反應結(jié)束后分析產(chǎn)物的熒光值變化曲線和熔解曲線,根據(jù)qRT-PCR反應檢測得到的CT值,采用2-ΔΔCT法計算每個樣本中目標基因的相對表達水平(ΔΔCT=ΔCT.Gene-ΔCT.Control,ΔCT.Gene為待測組目的基因與待測組內(nèi)參基因CT的差值,ΔCT.Control為對照組目的基因與內(nèi)參基因CT的差值)。每個樣本設(shè)3個反應重復,在同一批次完成目的基因和內(nèi)參基因的PCR反應。

2 結(jié)果

2.1 小麥條銹菌hsp70序列分析

克隆得到小麥條銹菌hsp70 cDNA序列的全長為2 267 bp,開放閱讀框為1 917 bp,編碼639個氨基酸,理論分子量為66.7 ku,理論等電點為5.15。以小麥條銹菌夏孢子基因組DNA為模板,根據(jù)克隆的hsp70 cDNA序列設(shè)計引物,擴增拼接得到2 817 bphsp70 基因組序列。通過和克隆的hsp70 cDNA比較,發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)含有7個內(nèi)含子,符合GT-AG 剪切法則,hsp70基因編碼區(qū)與非編碼區(qū)序列示意如圖1。

利用NCBI的BLAST比較分析,與擔子菌門真菌稈銹菌、灰蓋傘菌及子囊菌門真菌毛癬菌、曲霉等hsp70基因序列的相似度達79%～85%,與它們的氨基酸相似度達80%～92%(圖2)。細胞質(zhì)中高度保守的HSP70 C末端標志序列EEVD位于636～639。同時通過ExPasyProsite數(shù)據(jù)庫推導發(fā)現(xiàn)氨基酸序列中含有:10～17(IDLGTTYS)、195～208(IFDLGGGTFDVSLL)、332～346(IVLVGGSTRIPRIQK)3個HSP70蛋白家族高度保守的標簽序列。

圖1 小麥條銹菌hsp70基因組結(jié)構(gòu)與編碼蛋白示意圖Fig.1 Genomic structure and protein domains of Pst hsp70

2.2 高溫脅迫下小麥條銹菌hsp70的表達特征分析

熱激不同時間小麥條銹菌hsp70基因表達特征分析如圖3所示。以未經(jīng)熱激(0 min)處理的樣本為對照,經(jīng)28 ℃熱激處理后,兩個菌株hsp70的轉(zhuǎn)錄水平都有所增加。溫度高敏感類型菌株10-9-1-9在熱激后,hsp70的相對表達量與未經(jīng)處理的對照相比略有上升,2 h達到最高值也僅為未經(jīng)熱激處理對照樣本的2.1倍。溫度低敏感類型菌株11-6-4-1在受到熱激后,2 h之前相對表達量一直維持在較低的水平,但2 h時,hsp70相對表達量顯著增加,為未經(jīng)熱激處理對照樣本的17.4倍,3 h時回落至對照樣本表達量的2倍。

對溫度高、低敏感類型各3株代表菌株其hsp70在熱激2 h后的相對表達量分析結(jié)果見表3。以各菌株未經(jīng)熱激處理(0 min)為對照,不同溫度敏感類型菌株在熱激2 h后hsp70的相對表達量具有顯著差異。溫度低敏感類型菌株在熱激2 h后,hsp70的相對表達量均高于溫度高敏感類型菌株。低敏感類型菌株hsp70平均表達量為未經(jīng)處理對照的7.12倍,而高敏感類型菌株hsp70平均表達量僅為對照的1.63倍。

圖2 條銹菌與其他真菌HSP70氨基酸序列相似性分析Fig.2 Protein sequence alignment and similarity analysis of Pst HSP70 compared with other fungi

圖3 熱激不同時間小麥條銹菌hsp70基因表達特征Fig.3 Relative expression levels of Pst hsp70 with different heat shock processing times

類型Type菌株Isolate相對表達量Relativeexpressionlevel平均值Mean低敏感型Low-temperaturesensitivity11-6-4-16.72b11-20-3-36.64b7.1211-13-2-228.01a高敏感型High-temperaturesensitivity10-9-1-92.21c10-5-2-81.98c1.6310-17-2-50.69d

1) 數(shù)據(jù)后標注的不同小寫字母表示差異顯著(P=0.05)。

Different lowercase letters indicate significant difference.

以上結(jié)果表明,熱激條件下,hsp70在溫度高、低敏感類型的表達特征具有明顯差異,溫度低敏感類型菌株的相對表達量顯著高于溫度高敏感類型菌株,證實小麥條銹菌HSP70在病菌抵御熱脅迫過程中發(fā)揮了一定作用。

3 討論

小麥條銹病是一種典型的低溫病害,溫度是控制該病害發(fā)生與流行的重要環(huán)境因子。以往的研究表明,小麥條銹病在冷涼潮濕的地區(qū)發(fā)病嚴重,但近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌對溫度的適應性有所增強。生物體在受到高溫或其他不利條件傷害時,會激發(fā)其本身的應激作用。熱激蛋白在此作用中發(fā)揮著獨特的功能。在熱激條件下,大部分生物體正常蛋白合成受阻,誘導型熱激蛋白則開始合成,該蛋白可保護機體內(nèi)其他蛋白免遭損傷或修復已經(jīng)受損的蛋白,從而起到保護生物體的作用[20]。

本研究克隆了一個小麥條銹菌hsp70基因,翻譯后得到的氨基酸序列含有HSP70蛋白家族的3個典型標簽,而且與其他真菌HSP70氨基酸序列具有較高的同源性,表明該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于HSP70蛋白家族。另外,在其氨基酸序列的C末端存在高度保守的細胞質(zhì)特異性EEVD調(diào)控基序,說明該蛋白是一種細胞質(zhì)HSP70。

熱激蛋白HSP70包含組成型和誘導型兩種,組成型的HSP70對維持細胞基本生理功能和形態(tài)起重要作用,在正常條件下表達活躍,但不會對外界脅迫產(chǎn)生響應,而誘導型HSP70在正常生理條件下不存在或表達量很低,但能夠在外界脅迫條件下被強烈誘導,從而達到保護機體免受傷害的作用,誘導型熱激蛋白的累積決定著真核生物細胞的耐熱性[13]。本研究中,分析了不同溫度敏感類型小麥條銹菌經(jīng)28 ℃熱脅迫后hsp70基因的表達特征,發(fā)現(xiàn)該基因的表達量經(jīng)熱激處理后誘導表達,且溫度低敏感類型菌株(耐高溫菌株)的表達量顯著高于溫度高敏感類型菌株。說明HSP70在低敏感類型菌株抵御高溫脅迫的過程中起到了積極作用。推測,在熱激條件下,HSP70蛋白開始合成,合成的熱激蛋白可保護機體,克服脅迫條件對機體帶來的損傷。

HSP70的功能不只體現(xiàn)在其對熱脅迫的響應,在生物體受到其他不良環(huán)境的影響時,其合成也會發(fā)生變化[13]。本文針對小麥條銹菌hsp70在熱脅迫下的表達特征進行了研究,但關(guān)于其在紫外線、重金屬鹽等其他脅迫條件下的表達特征仍需進一步分析。

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(責任編輯：田 喆)

Cloning of a heat shock protein genehsp70 ofPucciniastriiformisf.sp.triticiand its expression in response to high-temperature stress

Cao Huaning, Liu Bo, Liu Taiguo, Gao Li, Chen Wanquan

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193, China)

To determine the response ofPucciniastriiformisf.sp.triticiheat shock protein 70 to high-temperature stress, thePsthsp70 gene was cloned via RACE and PCR, and mRNA expression ofhsp70 was determined in representative isolates with low-and high-temperature sensitivity during the heat shock process. The whole genomic DNA sequence ofhsp70 was 2 817 bp, including 7 introns, and the cDNA sequence was 2 267 bp, including an opening reading frame of 1 917 nucleotides. The ORF encodes a HSP70 protein of 639 amino acids, which had a theoretical pI/MW of 5.15/66.7 ku and contained three HSP70 family signature domains. Following heat shock at 28 ℃, expression ofhsp70 transcripts was up-regulated in the isolates with high-and low-temperature sensitivity, and reached the maximum level 2 hours after treatment. However, the average expression level was increased by 7.12-fold upon heat shock for 2 h in the isolates with low-temperature sensitivity, but only 1.63-fold in the isolates with high-temperature sensitivity.

wheat stripe rust; temperature sensitivity; HSP70; clone; qRT-PCR

2014-04-21

2014-12-11

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(“973”計劃)(2013CB127704);國家自然科學基金項目(31100110)；國家科技支撐計劃(2012BAS19B04);國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位專家專項經(jīng)費(CARS-03-04B)

S 435.121.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.004

* 通信作者 E-mail:bliu@ippcaas.cn；wqchen@ippcaas.cn