三種黃酮清除自由基活性的研究*

鄒淑君，許樹(shù)軍，付起風(fēng)，徐 暘*

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)a.藥學(xué)院；b.實(shí)驗(yàn)中心，黑龍江哈爾濱150040）

三種黃酮清除自由基活性的研究*

鄒淑君a，許樹(shù)軍b，付起風(fēng)b，徐 暘a*

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)a.藥學(xué)院；b.實(shí)驗(yàn)中心，黑龍江哈爾濱150040）

為比較黃酮2、3位單雙鍵不同及3'、4'鄰位取代基不同對(duì)清除自由基活性的影響。采用UV-Vis光譜法測(cè)定了木犀草素、香葉木素及橙皮素對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧陰離子自由基（·）的清除作用。結(jié)果顯示3種黃酮化合物對(duì)兩種自由基都有一定的清除作用，清除效果隨濃度的增大而增大。但對(duì)自由基清除能力表現(xiàn)為木犀草素遠(yuǎn)強(qiáng)于香葉木素、香葉木素與橙皮素?zé)o顯著差別。說(shuō)明具有B環(huán)3'、4'鄰二羥基結(jié)構(gòu)的黃酮清除自由基的能力明顯強(qiáng)于具有B環(huán)3'羥基、4'甲氧基結(jié)構(gòu)的黃酮；黃酮C環(huán)2、3位單雙鍵不同對(duì)自由基清除能力影響不顯著。

黃酮；木犀草素；香葉木素；橙皮素；自由基；清除

自由基是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物，過(guò)量的活性氧會(huì)引起細(xì)胞的氧化及病變，從而造成機(jī)體的疾病、衰老等。因此，保證體內(nèi)活性氧的含量處于正常水平是保證健康的重要前提。除了機(jī)體自身的調(diào)整，還可以通過(guò)攝入一些具有抗氧化性的物質(zhì)來(lái)清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧，維持體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡。黃酮類化合物就是這樣一類具有抗氧化活性的物質(zhì)。測(cè)定黃酮類化合物體外清除自由基的能力，并研究結(jié)構(gòu)與清除效果的關(guān)系，能夠?yàn)辄S酮類化合物在藥物、食品及添加劑方面的選擇和應(yīng)用提供一定的理論支持。

黃酮因其結(jié)構(gòu)中往往含有多個(gè)酚羥基及大的離域共軛性而顯示明顯的自由基清除活性，黃酮類化合物中的羥基數(shù)目、羥基的位置、C環(huán)的不同等結(jié)構(gòu)差異都對(duì)自由基清除活性有明顯的影響[1]，是值得深入探索的問(wèn)題。為此，本研究利用DPPH自由基體系、鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基體系，借助紫外-可見(jiàn)吸收光譜法進(jìn)行測(cè)試，選取木犀草素、香葉木素及橙皮素這3種黃酮類化合物（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），考察黃酮清除自由基能力的構(gòu)效關(guān)系。

圖1 3種黃酮的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of three flavonoids

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑、儀器

木犀草素、香葉木素及橙皮素（均為98%）（西安小草科技有限公司）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH日本東京化成株式會(huì)社）；三羥甲基氨基甲烷（Tris 99.8%上海博宏生物科技有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PB-20型pH計(jì)（德國(guó)賽多利斯儀器有限公司）；SK250LH型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；XS105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；移液槍（美國(guó)Labnet公司）；UV-1601型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除作用測(cè)定3種黃酮首先加少量甲醇溶解后，用去離子水定容配制成5.0×10-4mol·L-1的初始溶液。實(shí)驗(yàn)均以去離子水為參比，于517nm下測(cè)定。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)效果，將5.0×10-4mol·L-1的橙皮素及香葉木素液按比例稀釋獲得4.0×10-4、3.0× 10-4、2.0×10-4、1.0×10-4、4.0×10-5及1.0×10-5mol· L-1的樣品溶液供本實(shí)驗(yàn)用，將木犀草素溶液稀釋獲得3.0×10-4、2.0×10-4、1.0×10-4、7.5×10-5、5.0×10-5、2.5×10-5、1.0×10-5、7.5×10-6及5.0×10-6mol· L-1的樣品溶液供實(shí)驗(yàn)用。

第一組試驗(yàn)取3mL去離子水與3mL 6.5×10-5mol·L-1的DPPH·溶液混合搖勻，于40℃恒溫避光靜置30min后測(cè)定吸光度A0為0.2667；第二組試驗(yàn)分別取3mL不同濃度的樣品溶液，并分別加入3mL 6.5×10-5mol·L-1的DPPH·溶液，搖勻后于40℃恒溫避光靜置30min后測(cè)定吸光度Ai；第三組試驗(yàn)取3mL不同濃度樣品溶液（與第二組樣品對(duì)應(yīng)）與3mL去離子水混勻后測(cè)吸光度

相同條件下，向10mL比色管加入pH值為8.2的Tris-HCl緩沖溶液5.0mL、濃度為4.0×10-4mol· L-1待測(cè)液分別為100、200、500、800、1000、1500、2000μL加去離子水定容至10mL，搖勻，做空白對(duì)照；另向10mL比色管加入pH值為8.2的Tris-HCl緩沖溶液5.0mL、同濃度的對(duì)應(yīng)體積的待測(cè)液、及鄰苯三酚溶液0.3mL、最后加去離子水定容至10mL，迅速搖勻后測(cè)定吸光度，每30s記錄1次，直到反應(yīng)啟動(dòng)3min結(jié)束。經(jīng)計(jì)算處理獲取加樣品時(shí)鄰苯三酚自氧化速率νc[4，5]。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用

DPPH·溶液在517nm左右有特征吸收峰，當(dāng)具有自由基清除能力的抗氧化劑存在時(shí)，由于抗氧化劑與DPPH·的單電子配對(duì)，繼而使其吸收逐漸消失，且其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因此可用紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行定量分析，樣品的抗氧化活性可以通過(guò)清除DPPH·的量來(lái)評(píng)價(jià)[6]。DPPH與抗氧化劑（AH）的反應(yīng)如下式所示[7]：

DPPH·+AH→DPPH-H+A·

當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的單電子由于被配對(duì)，DPPH·濃度減小而使其顏色變淺，在517nm波長(zhǎng)處的吸光度會(huì)減小。根據(jù)計(jì)算樣品溶液對(duì)DPPH·的清除率并作圖（A0為不加黃酮的DPPH的吸光度值,Aj為黃酮溶液的吸光度，Ai為加入黃酮后的DPPH溶液的吸光度值）。圖2即為3種黃酮類化合物對(duì)DPPH·的清除效果圖。

圖2 3種黃酮對(duì)DPPH·自由基的清除率Fig.2 Free radical scavenging rate of three kinds of flavonoids on DPPH·

由圖2可以看出，木犀草素對(duì)DPPH·有很強(qiáng)的清除能力，橙皮素和香葉木素對(duì)DPPH·也有較好的清除能力，隨著濃度的增加，清除率都呈上升趨勢(shì)，即在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量-效關(guān)系。3種黃酮對(duì)DPPH·的半數(shù)清除率見(jiàn)表1。

表1 3種黃酮對(duì)DPPH·的半數(shù)清除率（Ec50）Tab.1 Ec50of Three kinds of flavonoids on DPPH·

黃酮類物質(zhì)的抗氧化作用一般與其分子結(jié)構(gòu)中的羥基數(shù)目及位置等結(jié)構(gòu)因素有關(guān)，根據(jù)測(cè)試結(jié)果可以看出，被測(cè)的3種黃酮類化合物依據(jù)Ec50得到的清除DPPH·的能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋耗鹃夭菟剡h(yuǎn)強(qiáng)于橙皮素；橙皮素略強(qiáng)于香葉木素，但差異不明顯。相比之下，木犀草素在B環(huán)的3'和4'上的鄰位羥基使其具有很強(qiáng)的清除能力，香葉木素的3'和4'位上的鄰位羥基中的4'位羥基被甲氧基化，則對(duì)DPPH·的清除能力大大降低；C2~C3單雙鍵不同的香葉木素和橙皮素相比，二者沒(méi)有顯著差異。

2.2 黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

測(cè)試不加樣品的鄰苯三酚自氧化，初始記錄吸光度值為0.063，然后每30s記錄一次吸光度值，前3min的記錄值分別是：0.172、0.262、0.336、0.399、0.450、0.493。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，322nm處吸光度為縱坐標(biāo)，利用OriginPro8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)線性回歸計(jì)算處理得到其斜率即為鄰苯三酚自氧化速率ν0=0.00201s-1。

測(cè)試加樣品的鄰苯三酚自氧化，以初始記錄為起點(diǎn)，然后每30s記錄一次吸光度值，取前3min的記錄值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，322nm處吸光度為縱坐標(biāo)。利用OriginPro8.5進(jìn)行處理得到加入不同濃度的樣品后的鄰苯三酚自氧化速率νc。按實(shí)驗(yàn)用量計(jì)算測(cè)試時(shí)樣品濃度，根據(jù)清除率P=（[ν0-ν）c/ν0]× 100%計(jì)算，得各濃度下不同樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率并作圖，圖2為3種黃酮對(duì)·自由基清除作用效果圖。

圖3 3種黃酮對(duì)·自由基的清除率Fig.3 Free radical scavenging rate of three kinds of flavonoids on

從圖3可以看出，3種黃酮對(duì)超氧陰離子自由基都具有顯著的清除能力，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，清除率也呈濃度依賴性。且相同濃度下木犀草素對(duì)超氧陰離子的清除率明顯高于其它兩種。表2是3種黃酮對(duì)·自由基的半數(shù)清除率數(shù)據(jù)。

表2 3種黃酮對(duì)·自由基的半數(shù)清除率（Ec5）0Tab.2 Ecof Three kinds of flavonoids on·50

表2 3種黃酮對(duì)·自由基的半數(shù)清除率（Ec5）0Tab.2 Ecof Three kinds of flavonoids on·50

Ec50（mol·L-1）橙皮素9.09×10-5香葉木素8.49×10-4木犀草素4.31×10-6

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，證明木犀草素、香葉木素、橙皮素對(duì)DPPH·、·都具有一定的清除作用。且隨著濃度的增加，清除率呈上升趨勢(shì)，即呈現(xiàn)量-效關(guān)系。清除DPPH·和·的能力均顯示木犀草素明顯強(qiáng)于香葉木素及橙皮素；而香葉木素與橙皮素之間的差別不明顯。從構(gòu)效關(guān)系來(lái)分析，本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果為：（1）C2~C3之間的單雙鍵對(duì)DPPH·、·自由基清除能力影響不顯著；（2）B環(huán)3'、4'位鄰位羥基是對(duì)清除DPPH·、·自由基有突出作用的特征結(jié)構(gòu)，其中4'位羥基被甲氧基化后，則對(duì)自由基的清除能力顯著下降，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相一致[8]。

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圖4 PEW熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of PEW

可以看出，當(dāng)溫度達(dá)到220℃時(shí)仍然沒(méi)有失重，230℃恒溫30 min后失重僅有1.07%，達(dá)到266℃失重5.87%。說(shuō)明通過(guò)水裂解制得的PEW有較高的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

（1）裂解溫度對(duì)產(chǎn)品的影響最大，其次是反應(yīng)時(shí)間的影響。裂解溫度的升高和反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)都使得反應(yīng)體系獲得了更高的能量，容易使PE大分子發(fā)生斷鏈從而得到低分子量PE，繼而使產(chǎn)品性能發(fā)生了較大的變化。

（2）PEW產(chǎn)品的相對(duì)粘均分子量、熔程表現(xiàn)規(guī)律一致，即相對(duì)粘均分子量和熔程隨裂解溫度增加、時(shí)間延長(zhǎng)而減小。在裂解溫度為370℃，反應(yīng)時(shí)間60min，溶劑加入量50%的條件下，得到白色粉末狀的PEW，產(chǎn)品質(zhì)量收率為91.93%，熔程在104~110℃，酸值為0.0143，粘均分子量為3426.4，且熱穩(wěn)定性較高，在220℃仍然沒(méi)有失重，266℃僅失重5.87%，符合工業(yè)生產(chǎn)要求。

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Study on free radical scavenging activity of three kinds of flavonoids*

ZOU Shu-jun，XU Shu-jun，F(xiàn)U Qi-feng，XU Yang*
（a.Medicine School;b.Expenimental Center,Heilongjiang Univenity of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

In order to compare the free radical scavenging ability of hesperidin，diosmetin and luteolin,the scavenging reaction to 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·）and superoxide free radical（·）of hesperidin，diosmetin and luteolin were tested by UV-Vis spectrophotometry.The result show that three kinds of flavonoids are able to scavenge the two kinds of free radicals,and the scavenying capacity show a concentrationdependent manner.The scavenying activity of DPPH·and·of luteolin is significantly stronger than that of hesperidin and diosmetin．And the scavenying activity difference between hesperidin and diosmetin is not obvious．In flavonoids，B ring 3、4-two hydroxy is an important structural characteristic of free radical scavenging.Single or double bond between C2-C3 didn't has significant effect on free radical scavenging capacity.

flavonoids；diosmetin；luteolin；hesperetin；free radical；scavenging

TS201

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20150504

2015-03-12

黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目（No.12531648）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?；鹂蒲姓n題（201103）

鄒淑君（1974-），女,副教授，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)在站博士后工作人員，研究方向:藥物分析。

徐暘：女,副教授，研究方向:藥物分析。