胰島素調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4轉(zhuǎn)位的研究進展

于海佳

·綜述·

胰島素調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4轉(zhuǎn)位的研究進展

于海佳

胰島素抵抗和糖代謝異常是II型糖尿病的主要病理特征。機體在正常情況下通過胰島素等相關(guān)激素能夠非常精準地調(diào)控血液中的葡萄糖。伴隨著能量攝入，升高的血糖水平會刺激胰島β細胞分泌胰島素。血液中過量的葡萄糖被快速地轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，從而使機體維持正常的血糖水平。胰島素調(diào)控葡萄糖攝取主要是通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜上來實現(xiàn)的。有關(guān)胰島素是如何介導(dǎo)GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取的研究對于治療糖尿病和發(fā)展疾病早期診斷方法具有重要的意義。本文綜述了近年來在胰島素信號調(diào)控下GLUT4轉(zhuǎn)位方面的相關(guān)研究進展。

1 GLUT4與糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控

GLUT4是由SLC2A4基因編碼的糖轉(zhuǎn)運蛋白，能夠以不依賴于ATP、協(xié)助運輸?shù)姆绞竭\送葡萄糖穿過細胞質(zhì)膜。GLUT4具有12次跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域，廣泛分布于骨骼肌和脂肪組織等胰島素響應(yīng)性組織中［1-2］。除了GLUT4外，這些組織還表達其他的一些糖轉(zhuǎn)運蛋白，例如GLUT1。與其他糖轉(zhuǎn)運蛋白不同的是，GLUT4在細胞內(nèi)的分布受到胰島素的調(diào)控。GLUT1等其他糖轉(zhuǎn)運蛋白主要在基礎(chǔ)狀態(tài)（血糖水平低）下介導(dǎo)細胞對葡萄糖的攝取，而GLUT4在基礎(chǔ)狀態(tài)主要存在于胞內(nèi)的各種膜結(jié)構(gòu)中，只有少于5%的GLUT4位于細胞膜上。當(dāng)機體進食后血糖水平快速升高，葡萄糖會促進胰島素分泌增加。胰島素促使GLUT4從胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到細胞膜表面上，細胞表面上的GLUT4濃度在胰島素的刺激下可以增加到其在基礎(chǔ)狀態(tài)時的5～30倍［3］。GLUT4通過攝取和清除血液中的葡萄糖來維持血糖平衡。當(dāng)胰島素濃度降低時，GLUT4通過胞吞作用回到細胞內(nèi)，細胞表面的GLUT4重新恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)時的水平。

GLUT4在機體糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用，在II型糖尿病患者的脂肪組織中，GLUT4在mRNA和蛋白質(zhì)表達水平上都有明顯減少［4］。在小鼠模型中，GLUT4蛋白表達水平降低使小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗和糖尿?。?］。GLUT4在肌肉組織和脂肪組織中過量表達可以改善小鼠的血糖控制和糖耐受不良［6-7］。在細胞水平上，肌肉組織和脂肪組織中減少GLUT4的表達會引起肌肉細胞和脂肪細胞對葡萄糖的攝取減少并產(chǎn)生胰島素抵抗［8］。

2 胰島素調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)位的信號通路

對于胰島素調(diào)控骨骼肌和脂肪組織的葡萄糖攝取，目前研究者們認為主要是通過磷酸肌醇3激酶（PI3K）信號通路來實現(xiàn)的（圖1）。胰島素從胰島β細胞分泌后，首先結(jié)合細胞表面上的跨膜胰島素受體（IR）并激活胰島素受體酪氨酸激酶。這會促使胰島素受體底物蛋白（IRS）酪氨酸磷酸化，激活PI3K。PI3K與二磷酸肌醇（PIP2）發(fā)生作用，使PIP2轉(zhuǎn)化為三磷酸肌醇（PIP3）［9］。PIP3的水平升高激活了含有PH結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸激酶PDK1和mTORC2，并隨后激活蛋白激酶AKT。

AKT有3個異構(gòu)體，但是只有AKT2在胰島素刺激GLUT4轉(zhuǎn)運過程中起關(guān)鍵作用。George等［10］報道在胰島素抵抗和糖尿病中發(fā)現(xiàn)了AKT2突變。AS160（又稱為TBC1D4，分子量160 kD）是AKT2的一個重要底物，在脂肪和肌肉組織中過量表達AS160磷酸化位點突變體能抑制胰島素依賴的GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取，敲除AS160和其類似功能蛋白TBC1D1，可顯著減少胰島素刺激的葡萄糖運輸［11］。一份最新的報道發(fā)現(xiàn)格陵蘭人近年來持續(xù)升高的II型糖尿病發(fā)生率正是由于AS160發(fā)生了突變。研究人員證實了在2575個調(diào)查個體中有17%的AS160等位基因存在p.Arg684Ter突變，同時伴隨有胰島素抵抗和血糖升高［12］。AS160含有一個GTP酶激活蛋白（GAP）結(jié)構(gòu)域，其能特異地作用于G蛋白Rab。Rab是一類能促進囊泡運輸?shù)腉TP結(jié)合蛋白，通過與GDP結(jié)合的失活狀態(tài)向其活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化來催化膜運輸。作為一個負調(diào)控因子，AS160在基礎(chǔ)狀態(tài)下處于去磷酸化狀態(tài)，能通過GTP酶將GTP轉(zhuǎn)化成GDP。這使Rab蛋白處于失活狀態(tài)，從而抑制了GLUT4囊泡在細胞內(nèi)的運輸。在胰島素刺激下，AS160的五個氨基酸殘基Ser318、Ser570、Ser588、Thr642和Ser751被AKT2磷酸化而喪失了GAP活性［13］，使Rab蛋白可以與GTP結(jié)合，促進GLUT4囊泡運輸和GLUT4的膜轉(zhuǎn)位。在基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂肪細胞中敲低AS160的表達，會使部分GLUT4囊泡運輸至細胞表面，從而增加了細胞表面的GLUT4水平［14］。Rab10是AS160一個重要下游結(jié)合Rab蛋白。在脂肪細胞中敲低Rab10的表達會抑制胰島素引起的GLUT4轉(zhuǎn)位。在敲低AS160的同時敲低Rab10則會減弱基礎(chǔ)狀態(tài)時由于AS160缺失所引起的表面GLUT4增多現(xiàn)象［15］。另外，文獻報道的AS160的下游Rab蛋白除Rab10外，還有Rab8、Rab13和Rab14等［16-17］。

圖1 胰島素調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)運的分子機制

除PI3K信號通路外，胰島素還能激活c-Cbl/CAP和G蛋白TC10通路（圖1）。胰島素受體酪氨酸激酶被激活后，原癌基因c-Cbl與Cbl復(fù)合蛋白（CAP）形成的復(fù)合物與另一個胰島素受體底物蛋白APS結(jié)合，可以促使c-Cbl酪氨酸磷酸化［18］。磷酸化的c-Cbl/CAP復(fù)合物從胰島素受體脫離并轉(zhuǎn)移到脂筏區(qū)域，與蛋白CrkII和C3G作用。C3G激活Rho家族的小G蛋白TC10，TC10通過與其下游蛋白之間的相互作用來調(diào)控GLUT4的轉(zhuǎn)位過程［1-2］。

3 GLUT4的胞內(nèi)循環(huán)與運輸

受血糖水平和胰島素濃度的影響，胰島素響應(yīng)組織通過胞吐和胞吞來調(diào)節(jié)GLUT4在胞內(nèi)和細胞膜上的分布。研究胰島素調(diào)控下GLUT4在細胞內(nèi)各膜結(jié)構(gòu)與質(zhì)膜之間的穿梭過程對我們認識胰島素功能有重要的意義。

在基礎(chǔ)狀態(tài)下，GLUT4主要分布在反式高爾基網(wǎng)、GLUT4囊泡等胞內(nèi)區(qū)隔中，在內(nèi)體中只檢測到少量的GLUT4存在［19］。在胰島素的刺激下，可檢測到的GLUT4囊泡數(shù)量明顯減少，而GLUT4在內(nèi)體中的含量則迅速提高［20］。這說明GLUT4在這些胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)以及細胞質(zhì)膜之間的循環(huán)受胰島素信號的調(diào)控而不停地重新分布。在胰島素信號消失后，大量的GLUT4通過分選過程從內(nèi)體與質(zhì)膜的循環(huán)中分離出來形成GLUT4囊泡或者通過內(nèi)體逆向運輸?shù)椒词礁郀柣W(wǎng)。反式高爾基網(wǎng)上的GLUT4會進一步的生成GLUT4囊泡滯留在細胞內(nèi)從而脫離再循環(huán)。在胰島素信號的刺激下，滯留的GLUT4囊泡迅速運動到細胞皮層，通過與質(zhì)膜直接融合使GLUT4到達細胞表面［3］。

那么GLUT4囊泡是如何到達細胞皮層并拴系到細胞膜上的呢？有報道認為在脂肪組織中，大量存在的微管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能通過驅(qū)動蛋白KIF5B運送GLUT4囊泡［21-22］。到達皮層附近的GLUT4囊泡通過一些大的多蛋白復(fù)合物或伸長的桿狀分子將囊泡拴系到質(zhì)膜上。Exocyst復(fù)合物是一個由八個亞蛋白（Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70和Exo84）組成的拴系分子，其中的四個亞蛋白含有伸長的桿狀結(jié)構(gòu)，將囊泡與質(zhì)膜可以在相對遠的距離下連接起來［23］。在3T3L-1脂肪細胞中過量表達Exo70突變體，能抑制胰島素刺激的GLUT4上膜和葡萄糖攝取，但是并不影響GLUT4到質(zhì)膜的運輸［24］。電鏡結(jié)果顯示Exocyst可以形成一個“Y”形結(jié)構(gòu)，“Y”形的每一端通過不同的小G蛋白（如Rab10、TC10、RalA等）與質(zhì)膜和運輸囊泡相互作用，將GLUT4囊泡拴系到細胞質(zhì)膜上［23，25］。Exocyst的拴系作用只可以發(fā)生在約15 nm的距離內(nèi)，所以人們相信肌動蛋白（actin）有可能是另一個在遠距離下作用的拴系因子。在脂肪細胞中，肌動蛋白主要分布在細胞皮層附近，其聚合和穩(wěn)定性影響胰島素刺激下的GLUT4囊泡運輸。GLUT4囊泡上的肌球蛋白馬達MYO5和MYO1C可以結(jié)合肌動蛋白，通過肌動蛋白將GLUT4囊泡與質(zhì)膜拴系在一起［3］。MYO5和MYO1C與小G蛋白（如Rab10、RAL等）也相互作用，這將肌動蛋白、Exocyst復(fù)合物、AS160與GLUT4囊泡聯(lián)系在一起，它們之間的相互作用構(gòu)成了胰島素調(diào)控下的GLUT4囊泡運輸與拴系網(wǎng)絡(luò)［26］。

4 GLUT4的胞吐過程

胰島素調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)運的最后一個重要步驟是GLUT4的胞吐。GLUT4囊泡被拴系因子連接到質(zhì)膜上后，通過蛋白質(zhì)調(diào)控下的錨定和膜融合過程將GLUT4釋放到細胞膜表面。與胰島素分泌、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等其他胞吐過程一樣，GLUT4胞吐也需要其特定的可溶性N-乙基馬來亞胺敏感蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factorattachment protein receptor，SNARE）蛋白以及SM（Sec-1/Munc18）蛋白等SNARE調(diào)控因子的作用。通過全內(nèi)反射熒光顯微鏡（total internal reflection fluorescence microscope，TIRF）等方法發(fā)現(xiàn)膜融合是胰島素作用于GLUT4轉(zhuǎn)運的一個關(guān)鍵步驟［27］。一些SNARE調(diào)控蛋白如Munc18c、Synip等可以直接作為胰島素信號作用的終端分子來調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)位（圖1）。近年來，有關(guān)胰島素調(diào)控GLUT4胞吐的分子機制逐漸引起了人們的重視，研究GLUT4胞吐過程有可能為胰島素抵抗和II型糖尿病治療開辟新的藥物作用靶點。

4.1 SNARE蛋白

GLUT4囊泡與質(zhì)膜的融合過程需要通過SNARE蛋白來介導(dǎo)。膜融合是一個非自發(fā)的過程，需要外界提供一定的能量。位于質(zhì)膜上的t-SNARE（target-SNARE）蛋白和GLUT4囊泡上的v-SNARE（vesicle-SNARE）蛋白可以自發(fā)地聚合，形成非常穩(wěn)定的四螺旋束反式結(jié)構(gòu)SNARE復(fù)合物，將兩邊的膜拉近并促使膜融合的發(fā)生。目前在脂肪和肌肉組織中發(fā)現(xiàn)了11種的t-SNARE和6種v-SNARE蛋白，但是只有Syntaxin-4（t-SNARE）、SNAP23（t-SNARE）和VAMP2（v-SNARE）三種蛋白參與GLUT4囊泡與細胞質(zhì)膜的融合過程。Syntaxin-4和VAMP2各含有一個SNARE蛋白結(jié)構(gòu)域，而SNAP23有兩個SNARE結(jié)構(gòu)域。體外重組實驗顯示，SNARE蛋白能夠自發(fā)地促進不同膜結(jié)構(gòu)的融合，從而也說明這一過程還需要其他蛋白的介入以抑制或激活SNARE蛋白的聚合。胰島素信號通過調(diào)控SNARE與其結(jié)合蛋白的相互作用而達到對GLUT4囊泡與質(zhì)膜融合過程的調(diào)控。

4.2 Munc18c

SM蛋白是一類調(diào)控膜融合的分子量為60～70 kD的親水性蛋白。同SNARE蛋白一樣，SM蛋白在膜融合過程中也是不可缺少的。所以也有學(xué)者認為SNARE蛋白復(fù)合物和SM蛋白是組成所有膜融合過程的最基本蛋白質(zhì)機器［28］。Munc18c是參與GLUT4胞吐的主要SM蛋白［29］，最初對Munc18c功能的研究是通過在脂肪細胞中過量表達來進行的。研究者們發(fā)現(xiàn)Munc18c過量表達會抑制胰島素刺激引起的GLUT4轉(zhuǎn)運和葡萄糖攝取，因此Munc18c被認為是GLUT4轉(zhuǎn)運的負調(diào)控因子。Munc18c可以與t-SNARE蛋白Syntaxin-4結(jié)合從而抑制Syntaxin-4與SNAP23和VAMP2形成復(fù)合物。隨后的Munc18c基因敲低或敲除實驗卻證明Munc18c在胰島素調(diào)控的GLUT4轉(zhuǎn)運和葡萄糖攝取過程中是必不可少的［30］。體外實驗也顯示Munc18c能夠通過有效地促進GLUT4囊泡相關(guān)SNARE復(fù)合物的形成來加快膜融合的速度［31］。一些學(xué)者認為Munc18c的表達水平會影響其在GLUT4轉(zhuǎn)運中的功能，Munc18c表達量過高或過低都會引起不同程度的胰島素抵抗［29］。

作為胰島素受體的下游靶分子，Munc18c能以不依賴于PI3K信號通路的方式被胰島素受體直接磷酸化［32］。酪氨酸殘基Tyr219和Tyr521是在胰島素的刺激下被磷酸化的兩個位點［33］。Munc18c的磷酸化與Munc18c/Syntaxin-4的作用有關(guān)，磷酸化會促使Munc18c從Syntaxin-4解離。自由的Syntaxin-4與其他SNARE蛋白一起引發(fā)膜融合反應(yīng)，而Munc18c通過促進SNARE復(fù)合物的形成將進一步調(diào)控GLUT4囊泡與質(zhì)膜融合［31，33］。最近的一項研究也報道了胰島素信號會促進Syntaxin-4相關(guān)SNARE復(fù)合物的形成，并且這一過程與胰島素引發(fā)Munc18c磷酸化相關(guān)［34］。另外，有文獻報道磷酸化的Munc18c是酪氨酸磷酸酶PTPIB的一個底物，PTPIB缺失會使Munc18c磷酸化水平升高和從Syntaxin-4解離［35］。

4.3 鈣結(jié)合蛋白

胰島素信號能通過氧化應(yīng)激和三磷酸肌醇激活鈣離子通道增加細胞質(zhì)膜附近鈣離子的濃度，并影響GLUT4的轉(zhuǎn)位過程［36］。DOC2B（double C2-like domains beta）蛋白結(jié)合鈣離子后與t-SNARE和帶負電荷的磷脂作用，促進了SNARE復(fù)合物的形成［37］。DOC2B與SNARE蛋白的相互作用受胰島素信號的調(diào)控。在脂肪細胞中通過RNA干擾減少DOC2B的表達能夠抑制胰島素調(diào)控的葡萄糖攝取，胰島素功能在DOC2B敲除的小鼠中也有明顯減弱［38-39］。也有報道認為DOC2B可以調(diào)節(jié)Munc18c的功能。在胰島素信號作用下，磷酸化的Munc18c蛋白從Syntaxin-4解離，與DOC2B結(jié)合在一起［40］。

Esyt1（extended synaptotagmin like protein 1）具有五個C2結(jié)構(gòu)域，其中有兩個C2結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合鈣離子。在胰島素的刺激下，Esyt1能作為激酶CDK5的底物被磷酸化，并與GLUT4一起定位［41］。Esyt1在GLUT4轉(zhuǎn)位中的作用還需要進一步驗證。最近報道的另一個鈣結(jié)合蛋白CDP138是Akt2的一個底物，敲低CDP138會抑制胰島素引起的GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取。CDP138主要作用于GLUT4的胞吐，通過磷酸化S197位氨基酸和結(jié)合鈣離子來實現(xiàn)其調(diào)控功能［42］。而CDP138和Esyt1是否與SNARE蛋白直接作用以及如何調(diào)控GLUT4膜融合還需要進一步的研究。

4.4 Synip和Tomosyn

Synip和Tomosyn是胰島素調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)位的兩個負調(diào)控因子。作為Akt2的底物，Synip在基礎(chǔ)狀態(tài)時特異地結(jié)合Syntaxin-4和SNAP23，阻止錨定和膜融合的進行［43］。Akt2在胰島素信號下磷酸化Synip釋放Syntaxin-4，從而有利于SNARE復(fù)合物的形成、促進GLUT4轉(zhuǎn)位［44］。Tomosyn是一個非特異性的GLUT4轉(zhuǎn)位調(diào)控因子，除GLUT4轉(zhuǎn)位外還可以調(diào)控許多膜融合過程，如胰島素分泌、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等。Tomosyn的C端有一小段類似v-SNARE結(jié)構(gòu)的區(qū)域，可以有效地結(jié)合t-SNARE并抑制其與v-SNARE聚合。體內(nèi)實驗表明Tomosyn的調(diào)控作用不僅需要其C端v-SNARE結(jié)構(gòu)域，還需要其N端WD40重復(fù)片段區(qū)域［45］。至于Tomosyn的功能如何受胰島素的調(diào)控至今還是一個尚未解決的問題。

5 展望

糖尿病的發(fā)病原因至今尚未完全清楚。中國近幾十年來糖尿病發(fā)病率持續(xù)升高，使糖尿病的治療成為一個亟需解決的問題。II型糖尿病占糖尿病比例的90%左右，對胰島素調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)位的研究將有助于理解胰島素抵抗的發(fā)生機制，并針對各個環(huán)節(jié)設(shè)計和篩選治療糖尿病的藥物。目前以調(diào)控GLUT4表達、胰島素信號通路的各個環(huán)節(jié)為靶點，已成功發(fā)現(xiàn)了許多能夠增強GLUT4轉(zhuǎn)位并促進葡萄糖吸收的小分子化合物。隨著GLUT4轉(zhuǎn)位分子機制的深入研究，一些受胰島素調(diào)控的關(guān)鍵蛋白將可能成為治療胰島素抵抗新的干涉位點。

目前對GLUT4轉(zhuǎn)位的研究主要集中于胰島素信號通路以及GLUT4胞吐過程中的調(diào)控等過程，而對GLUT4在細胞內(nèi)的運輸過程研究的較少。已有報道證明不同于GLUT4胞吐過程中的SNARE蛋白（如Syntaxin-6）、SM蛋白（如Vps45）和Rab蛋白（如Rab5）調(diào)控GLUT4在胞內(nèi)膜系統(tǒng)中的運輸和分選，GLUT4如何在細胞內(nèi)運輸以及胰島素對這一復(fù)雜過程的調(diào)控將是未來GLUT4轉(zhuǎn)運研究的一個重點。盡管目前對GLUT4轉(zhuǎn)運的研究取得了很大的進展，但是與神經(jīng)遞質(zhì)釋放等胞吐過程的研究相比還有不小的距離，尤其是在已知調(diào)控因子的數(shù)量和作用機制方面。在基因和蛋白水平上對影響胰島素調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)運過程中參與蛋白的篩選將是一個十分重要的研究方向。另外，對于其他轉(zhuǎn)運和胞吐過程中發(fā)現(xiàn)的相對保守蛋白如Munc13蛋白等是否參與GLUT4轉(zhuǎn)運過程也需要進行重點研究。除RNA干擾外，TALEN、CRISPR/cas9等基因敲除和編輯技術(shù)的出現(xiàn)使科研人員能夠快速、定向地實現(xiàn)基因水平上的精確修飾。這些高效的基因編輯技術(shù)結(jié)合TIRF、冷凍電鏡等技術(shù)將給胰島素對GLUT4轉(zhuǎn)位的研究帶來新的發(fā)展機遇。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.011

80309美國，科羅拉多大學(xué)博爾德分校分子細胞發(fā)育生物學(xué)系，Email：haijia@colorado.edu

2014-08-18