天然來源的寡聚脫氧核苷酸活性產(chǎn)物研究進(jìn)展

郭妍，惠長野，熊偉，謝英，楊新躍

·綜述·

天然來源的寡聚脫氧核苷酸活性產(chǎn)物研究進(jìn)展

郭妍，惠長野，熊偉，謝英，楊新躍

單鏈寡聚脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）的生物學(xué)活性被證實與序列和空間構(gòu)象特征有關(guān)，使得ODN類藥物的開發(fā)成為近年來的研究熱點［1］。短鏈ODN庫如果由n個脫氧核苷酸（deoxynucleotide，nt）組成，理論上庫容量為4n，30 nt的ODN庫容量就高達(dá)1018。豐富的序列及空間構(gòu)象是ODN活性的基礎(chǔ)，高等真核生物和原核生物來源的ODN表現(xiàn)了不同的生物學(xué)活性。

在天然來源的高等真核生物ODN方面，歐洲的研究重點是傳統(tǒng)生化方法制備的ODN活性產(chǎn)物，其中最成功的就是意大利Gentium SpA公司開發(fā)的去纖苷（defibrotide，DF），豬源的主成分為45～90 nt的ODN混合物［2］。目前，DF臨床試驗主要圍繞肝小靜脈閉塞癥（hepatic venular occlusive disease，VOD）的預(yù)防和治療、多發(fā)性骨髓瘤的治療、腫瘤的輔助治療開展［2-4］。不同于脊椎動物，原核生物基因組富含CpG基序，基于此差異設(shè)計合成的CpG ODN在感染性、過敏性、免疫缺陷性疾病及腫瘤的免疫治療中表現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景［5］。下面對高等真核生物及原核生物基因組特點及兩種來源的ODN活性產(chǎn)物研究現(xiàn)狀分述如下。

1 高等真核生物及原核生物基因組特點

微生物在漫長的進(jìn)化過程中，通過改變相關(guān)蛋白及脂類的表達(dá)來逃避宿主的免疫識別［6］。然而相對其他菌體成分來說，細(xì)菌基因組DNA是所有菌體中較保守的組成。細(xì)菌DNA有著與脊椎動物DNA明顯不同的結(jié)構(gòu)特征，其中CpG二核苷酸出現(xiàn)頻率高，胞嘧啶呈未甲基化狀態(tài)；而脊椎動物DNA中CpG二核苷酸出現(xiàn)頻率低，并且60%～90%胞嘧啶第5碳原子甲基化［7］。這種差別使得細(xì)菌基因組在進(jìn)化過程中成為病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），從而能夠被脊椎動物所識別，并產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。

對GenBank中收錄的已完成全基因組測序的高等真核及原核生物基因組CpG基序含量進(jìn)行分析（表1），哺乳動物的CpG含量在2%～2.5%，鮭魚CpG含量也只有3.83%；相對于高等真核生物，原核生物CpG含量非常高，腸道益生菌嗜酸乳桿菌的CpG含量高達(dá)6.68%，致病菌結(jié)核分枝桿菌CpG含量甚至高達(dá)25.33%。圖1所示為各代表物種基因組序列中CpG基序（黑色突出顯示）局部分布情況。正是高等真核生物及原核生物基因組DNA這一明顯不同的結(jié)構(gòu)特征，使得兩種天然來源的ODN具有顯著不同的生物學(xué)活性。

2 高等真核生物來源ODN——去纖苷

DF的化學(xué)本質(zhì)是鏈長分布集中在45～90 nt（15～30 kD）的豬源ODN混合物，嘌呤嘧啶比大于0.85。DF可以通過靜脈注射及口服兩種方式給藥，鑒于消化道DNase水解、吸收效率及肝臟首過效應(yīng)等因素，DF口服生物利用度不足70%［8］。注射給藥DF的半衰期為10～30 min，而口服給藥DF的清除需要數(shù)小時，DF及其代謝產(chǎn)物主要通過尿液及糞便排出體外［9］。

表1 高等真核生物與原核生物CpG基序含量分析

圖1 真核生物與原核生物基因組中CpG分布局部截圖

生物學(xué)活性多樣性是DF最突出的特點，大量研究證實DF具有促纖溶、抗炎、抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化及抗腫瘤的活性［2，9-10］。DF一系列生物學(xué)活性主要是針對微血管產(chǎn)生的［11］。促纖溶和抗凝活性被認(rèn)為是通過提高血管內(nèi)皮組織纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）的表達(dá)，同時降低抑制因子（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）和組織因子（tissue factor，TF）分泌來產(chǎn)生的［12］。體外實驗證實DF是纖溶酶的激動劑，并可以增強肝素的抗凝活性［13］。大量的臨床研究是針對DF可以選擇性抗凝，并降低出血風(fēng)險的特性展開的［10，14-15］。DF用于VOD治療的臨床實驗已經(jīng)開展了I～I(xiàn)II期，預(yù)防VOD進(jìn)行了II～I(xiàn)II期臨床試驗［3，9］。腫瘤組織周圍多發(fā)新生血管，DF具有抗血管新生的作用，且這一活性的發(fā)揮并不依賴于表皮生長因子受體［16-17］。體外實驗證實DF可以提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，這些都表明DF在抗腫瘤治療方面有廣闊的開拓前景［18］。目前，DF用于多發(fā)性骨髓瘤的治療已經(jīng)進(jìn)入了II期臨床試驗階段。

2.1 去纖苷生物學(xué)活性基礎(chǔ)

已有的研究雖然揭示了DF多樣的生物學(xué)活性，但對DF活性序列特征、堿基組成、鏈長、作用受體等分子機制的了解并沒有深入。DF的ODN主成分鏈長集中在45～90 nt，圖2A為DF 5%～20%尿素變性PAGE膠銀染分析結(jié)果，DF電泳條帶呈拖尾狀，鑒于銀染的高靈敏度，可以看出DF鏈長實際分布范圍很廣；2%瓊脂糖電泳表明DF主要為小分子ODN（圖2B）；DF凝膠過濾HPLC圖譜呈前沿峰（圖2C）。HPLC是DF分子量最常用的分析手段［19］。DF作為難于質(zhì)控的多組分生化藥，除分子量分布外，其他可參考的理化參數(shù)如下：①DF所包含隨機序列分子式為P1-5（dAp）12-24（dGp）10-20（dTp）13-26（dCp）10-20，這就限定了DF類似物制備的原料來源，要求原料DNA至少具有和豬源DNA相近的GC含量；②酸水解制備DF過程中，會有脫嘌呤現(xiàn)象發(fā)生，脫嘌呤過高會嚴(yán)重影響DF生物學(xué)活性，因而限定DF的嘌呤嘧啶比要大于0.85，這對DF類似物的制備方法提出了挑戰(zhàn)。

凝膠過濾層析對DF進(jìn)行分子量分級，體外促纖溶活性與DF分級組分的平均分子量呈正相關(guān)，20 nt以下組分則完全喪失促纖溶活性［13］。然而，DF分子量分級得到的12～30 nt（4～10 kD）的ODN卻表現(xiàn)了良好的局部抗缺血活性，并在免疫抑制治療過程中起到內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)功能［20］。DF生物學(xué)活性一方面和其多聚陰離子的特性有關(guān)；另一方面，DF作為ODN混合物，其分子內(nèi)存在堿基的互補配對，這些構(gòu)成了DF序列多樣性和空間構(gòu)象多樣性的基礎(chǔ)，推測與其多種生物學(xué)活性直接相關(guān)。DF類似于豬源的ODN文庫，很多學(xué)者嘗試用SELEX的技術(shù)篩選DF，用核酸適配體理論去證明或解釋DF的各種生物學(xué)活性，但結(jié)果不令人滿意。DF活性的多樣性取決于ODN混合物序列、長度及構(gòu)象的多樣性，這一理論被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同［4，14］。

圖2 DF分子量分布分析（A：5%～20%梯度變性PAGE電泳；B：2%瓊脂糖凝膠電泳；C：凝膠過濾HPLC）

2.2 高等真核生物來源的ODN

Gentium SpA公司建立了哺乳動物來源DNA化學(xué)可控降解方法，并成功用于DF的制備［21］。近年來的研究表明DF生物學(xué)活性的發(fā)揮與ODN混合物序列、長度及構(gòu)象特征等有關(guān)。高等真核生物基因組DNAGC含量、序列特征相近（表1），哺乳動物來源如豬源、牛源基因組DNA是DF及其類似物的理想制備原料來源［22-23］。鮭魚精DNA資源豐富，價格低廉，是功能性食品及核酸藥品生產(chǎn)的最主要原料來源，且GC含量與哺乳動物接近，是哺乳動物DNA的理想替代品。利用鮭魚精來源DNA，我們建立了高溫酸性條件下水解的方法，制備的鏈長集中在45～90 nt的ODN，在體內(nèi)、體外均表現(xiàn)出了促纖溶的活性，有望成為新型的抗凝劑［19］。

3 原核生物來源ODN——CpG ODN

早在19世紀(jì)后期，學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤患者注射少量的天然細(xì)菌制品可以明顯減輕其癥狀，就是因為細(xì)菌DNA介導(dǎo)了這種抗腫瘤作用［24］。后續(xù)的研究證實，含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸片段（CpG containing oligodeoxynucleotide，CpG ODN）是細(xì)菌DNA的最小作用單位，能夠完全模擬細(xì)菌DNA發(fā)揮免疫刺激作用［25］。胞嘧啶甲基化可導(dǎo)致活性減半，而核心基序C與G順序顛倒則活性完全喪失［26］。

3.1 CpG ODN來源

早期的研究均采用熱變性的單鏈大分子細(xì)菌基因組DNA，由淋巴細(xì)胞加工生成CpG ODN［7，25，27-29］。但細(xì)菌基因組DNA分子量大，一方面細(xì)胞攝取率低；另一方面難于純化去除菌體蛋白、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，臨床試驗安全性低，因而僅局限于實驗室研究［25，28］。超螺旋質(zhì)粒DNA可實現(xiàn)規(guī)模發(fā)酵、制備，內(nèi)毒素、菌體蛋白等雜質(zhì)易去除，可達(dá)到注射用藥標(biāo)準(zhǔn)［30］，富含CpG基序的重組質(zhì)粒在獸醫(yī)臨床中得到應(yīng)用［31-32］。模擬淋巴細(xì)胞降解并遞呈CpG ODN的過程，研究者通過人工合成的方法制備出CpG ODN，其表現(xiàn)出了與細(xì)菌DNA相似的免疫刺激活性。

目前，人工合成的CpG ODN被認(rèn)為是一種有效的免疫佐劑和治療劑而被應(yīng)用于臨床研究。CpG單藥抗腫瘤的作用已在黑色素瘤、膀胱癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤和肺癌等多種動物模型中得到了研究，證實其具有預(yù)防和消除實體瘤的療效［33］。CpG ODN與腫瘤疫苗、單克隆抗體、化療等聯(lián)合用于抗腫瘤的臨床研究也取得了滿意的療效［5］。

3.2 人工合成的CpG ODN

人工合成的CpG ODN根據(jù)結(jié)構(gòu)和免疫刺激作用特點主要將其分為4種類型（表2）。利用磷硫酰骨架取代磷酸二酯鍵可抵抗核酸內(nèi)切酶的水解，延長CpG ODN體內(nèi)半衰期，但化學(xué)修飾對活性是否有影響還存在爭議［34-35］。為了提高CpG ODN的TLR9激活效應(yīng)，通常在一條ODN鏈上串聯(lián)多個CpG基序，如B、C、P型ODN的設(shè)計［36］。也可引入回文序列，將CpG呈現(xiàn)于發(fā)夾結(jié)構(gòu)頂端利于其與TLR9結(jié)合［36］。天然來源的菌體DNA具有序列多樣性，而人工合成的CpG ODN序列單一，鑒于CpG ODN具有種屬特異性的特點，圍繞著如何設(shè)計通用型CpG ODN，在串聯(lián)多個CpG基序的同時，引入人和鼠共識別的六核苷酸基序，如GTCGTT和GACGTT［34］。用于臨床研究的ODN序列均較長，主要集中在22～24 nt［5，24］。

3.3 CpG ODN新來源

盡管人工合成DNA技術(shù)不斷改進(jìn)，但CpG ODN用藥劑量大，合成法制備成本仍非常高。在對序列進(jìn)行優(yōu)化，骨架進(jìn)行修飾的同時，圍繞著如何提高CpG ODN生物利用度、改良劑型的報道也較多。納米粒攜帶可以促進(jìn)細(xì)胞攝入CpG ODN，加強其免疫刺激效應(yīng)［37-38］。如脂質(zhì)體納米粒不但提高了CpG ODN生物利用度，還可促進(jìn)TLR9由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遷移至內(nèi)體，在內(nèi)體艙內(nèi)與CpG相互作用［39-40］。

CpG ODN化學(xué)合成的成本高，限制了其作為免疫佐劑在臨床尤其是獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用。國內(nèi)外很多學(xué)者嘗試擴展CpG ODN的來源，并作為畜禽疫苗佐劑。相對于菌體基因組DNA，質(zhì)粒DNA具有可獨立大量復(fù)制、易于純化的優(yōu)點，作為DNA疫苗載體應(yīng)用于人體，其安全性和有效性得到了充分證實［30］。將不同長度和不同CpG基序的DNA片段插入質(zhì)粒，構(gòu)建富含CpG的重組質(zhì)粒，經(jīng)大腸桿菌發(fā)酵、菌體裂解、純化等生物工程下游技術(shù)可大規(guī)模制備CpG重組質(zhì)粒，研究證實CpG重組質(zhì)粒具有和人工合成的CpG DNA相同的免疫刺激活性，可提高口蹄疫、禽流感滅活疫苗抗體水平2～4倍［31-32］，增加畜禽抵抗感染性疾病的能力［41］。CpG重組質(zhì)粒可在動物體內(nèi)停留8～16 d，無基因組整合風(fēng)險，符合農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價的要求［42］。

表24 種類型CpG ODN結(jié)構(gòu)特點及免疫功能對比

4 結(jié)語與展望

DF最初是由豬小腸黏膜基因組DNA通過控制解聚制得［21］。豬源臟器是應(yīng)用最為廣泛的生化制藥原料，肝素、硫酸軟骨素、胰島素等傳統(tǒng)生化藥物品種都提取自豬臟器，其安全性、有效性經(jīng)過了反復(fù)驗證，這可能是DF原料選擇的初衷，但正是這點大大限制了DF的來源，DF適應(yīng)證目前正從VOD擴大到腫瘤用藥，首要解決的就是來源有限的問題。鮭魚DNA是哺乳動物來源DNA的理想替代品，利用改良的化學(xué)可控降解方法制備各類分子量分布的ODN，針對DF主要作用靶點內(nèi)皮細(xì)胞和血小板，有望篩選得到新型的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)劑及抗凝劑。

人工合成CpG ODN技術(shù)成熟，但作為免疫佐劑及治療劑用藥劑量大［0.1～0.5 mg/（kg·d）］，化學(xué)合成成本高，因而目前臨床試驗主要圍繞抗腫瘤及腫瘤的輔助治療開展，在感染性疾病的治療方面應(yīng)用有限［26］。人工合成的CpG ODN長度在20～30 nt活性最強，小于8 nt則完全喪失生物學(xué)活性［24-25，34］。如果能將原核生物如細(xì)菌DNA體外降解為25 nt左右的ODN片段，每條鏈上的CpG基序平均將高達(dá)2～3個。是否能將DF及其類似物的制備方法用于細(xì)菌DNA的降解，在降解制備源于細(xì)菌的天然CpG ODN方面實現(xiàn)技術(shù)突破，值得進(jìn)一步研究。該方法成本極其低廉、質(zhì)量可控，有望成為CpG ODN的理想來源。

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