白介素13基因＋2044G／A多態(tài)性與支氣管哮喘的關(guān)聯(lián)研究

席素雅 劉建強(qiáng) 陳樹珍 張玲 王少穎

（1.河北省胸科醫(yī)院呼吸科；2.河北省老年病醫(yī)院，河北 石家莊 050000）

支氣管哮喘（哮喘）是一種以氣道阻塞、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)為特征的炎癥性疾病，呈家族聚集性，其發(fā)病涉及了遺傳、環(huán)境、免疫、神經(jīng)等因素［1］。多項(xiàng)研究［2－3］表明，白細(xì)胞介素13（IL－13）基因多態(tài)性與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)。本研究以河北地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR－RFLP）方法，分析該地區(qū)正常人群和哮喘患者IL－13基因＋2044G／A 的基因型和等位基因頻率分布情況，以探討該基因多態(tài)性與河北地區(qū)漢族人群哮喘的相關(guān)性，為哮喘患者的早期預(yù)防、早期治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 哮喘組：選擇2011年7月至2013年7月河北省胸科醫(yī)院收治的哮喘患者100例，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組2013年制定的《支氣管哮喘防治指南》標(biāo)準(zhǔn)［4］，其中男48例，女52例，年齡20～65歲。對(duì)照組：同期選擇我院體檢中心健康體檢者100例，男50例，女50例，年齡18～66歲，該組人群均無(wú)哮喘病史。兩組人群年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究對(duì)象均為無(wú)血緣關(guān)系的我國(guó)北方漢族人，除外罹患嚴(yán)重全身感染、腫瘤、心臟病及肝、腎疾病等系統(tǒng)性疾病。全部入選對(duì)象均提前征得患者同意并填寫知情同意書。

1.2 方法（1）基因組DNA 提?。喝⊥庵苎?mL，加入含1.5mg／mL乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－Na2）的抗凝管中，搖勻，常規(guī)酚－氯仿法抽提基因組DNA，－20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩CR－RFLP檢測(cè)基因型：聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增基因組DNA。參照文獻(xiàn)［5］，IL－13基因＋2044G／A 位點(diǎn)引物序列如下：上游：5′－CTTCCGTGAGGACTGAATGAGACGGTC－3′，下 游：5′－GCAAATAATGATGCTTTCGAAGTTTCAGTGGA－3′。25μL PCR反應(yīng)體系中含：10×緩沖液2.5μL；4×脫氧三組磷組酸組核組苷（dNTP，10 mmol／L）2.0μL；MgCl2（25mmol／L）2.5組μL，10組μmol／L組引組物組各1.0μL，模板DNA（10μmol／L）3.0μL；rTaq DNA聚合酶（5U／L）0.25μL，去離子水加至25μL。擴(kuò)增反應(yīng)在熱循環(huán)儀上完成。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸5min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Pst I于37 ℃水浴消化8h，再在3%瓊脂糖凝膠上加溴化乙錠（終濃度為0.7μg／mL），取8μL酶切產(chǎn)物在凝膠上上樣電泳，紫外線燈照射下觀察拍照。（2）測(cè)序：PCR 產(chǎn)物純化并送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。研究資料的可靠性通過Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)檢測(cè)，基因型和等位基因頻率通過基因計(jì)數(shù)法計(jì)算。單個(gè)基因型及組間等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IL－13基因型分析 IL－13基因＋2044G／A 多態(tài)性位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為236bp，其上游引物設(shè)計(jì)的錯(cuò)配堿基G 使該位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物均存在一個(gè)NIaIV 酶切位點(diǎn)，均會(huì)被切下一26bp產(chǎn)物。經(jīng)酶切后，電泳結(jié)果可見3種基因型：GG 型（含酶切位點(diǎn)的純合子，酶切產(chǎn)物為178bp、32bp及26bp）；AA 型（不含酶切位點(diǎn)的純合子，酶切產(chǎn)物為210bp和26bp）；GA 雜合子型（雜合子，酶切產(chǎn)物為210bp、178bp、32bp和26bp）。酶切結(jié)果見圖1，由于32bp和26bp分子量較小，電泳時(shí)均已出膠。隨機(jī)選取3 種基因型樣本的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其結(jié)果與PCR－RFLP結(jié)果完全一致。

圖1 IL－13基因＋2044G／A 多態(tài)性PCR 產(chǎn)物NIaIV 酶切電泳結(jié)果

2.2 兩組IL－13基因＋2044G／A 基因型和等位基因分布頻率比較（1）經(jīng)Hardy－Weinberg 平衡檢驗(yàn)，兩組基因型符合遺傳平衡，具有群體代表性。見表1。（2）IL－13＋2044G／A 位點(diǎn)基因多態(tài)性分布特點(diǎn)：IL－13基因＋2044G／A組多態(tài)性有3組種基因型，GG組型、AA組型、GA組型，兩組組人組群組中組均組以GG組型組為主，GA 型次之，AA 型最少。分析顯示：哮喘組IL－13＋2044G／A 位點(diǎn)基因型分布與正常對(duì)照組有差異（χ2=7.71，P＜0.05）。A 等位基因攜帶者（GA＋AA 基因型）在哮喘組（49例，49.0%）明顯高于對(duì)照組（30例，30.0%）（χ2=7.55，P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 IL－13基因＋2044G／A 位點(diǎn)基因型分布的Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)（%）

表2 IL－13基因外顯子＋2044G／A 多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較［n（%）］

3 討論

支氣管哮喘是由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)生過程中有多種細(xì)胞因子參與。IL－13是一種主要由活化的CD4＋Th2細(xì)胞分泌的多效能細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)功能，通過提高B細(xì)胞的活性、刺激B 細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)IgE的合成，從而導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高以及小氣道結(jié)構(gòu)重建，參與哮喘炎癥的發(fā)生與維持［6］。

人IL－13（hIL－13）基因序列長(zhǎng)度為4.6kb，含有4個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子。編碼hIL－13的基因定位于5q31，分子量約12KD，是由132個(gè)氨基酸組成的非糖基化蛋白。近年國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究［7－11］及Meta分組析［12－14］顯組示，IL－13基組因A2044G組單核組苷組酸多態(tài)性與哮喘發(fā)病密切相關(guān)，是哮喘發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。文獻(xiàn)［7－11］研究發(fā)現(xiàn)，＋2044G／AA 等位基因與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)。而華麗等［15］研究發(fā)現(xiàn)，G 等位基因可能是哮喘的易感基因。

本研究以河北地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，分析了100例哮喘患者和100例健康人群的IL－13 ＋2044G／A 基因型和等位基因分布頻率。結(jié)果顯示，中國(guó)北方漢族人群IL－13 基因＋2044G／A 位點(diǎn)存在G→A 突變，且該基因型已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。哮喘組AA 型和A 等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，A 等位基因頻率在哮喘組（29.5%）明顯高于對(duì)照組（17.5%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明A等位基因可能是河北地區(qū)哮喘發(fā)病的易感基因。

研究發(fā)現(xiàn)，IL－13基因第4外顯子的2044位堿基存在G→A 突變，從而導(dǎo)致編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的多態(tài)鏈第130位氨基酸由精氨酸（Arg）轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０罚℅ln），Gln 可能促進(jìn)受體與IL－13 結(jié)合，由于空間結(jié)構(gòu)的改變使IL－13 信號(hào)傳導(dǎo)途徑JAKSTAT6異常，從而影響IL－13的生物學(xué)活性。因此在堿基改變的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從蛋白功能角度研究這一改變對(duì)IL－13 轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的影響，將對(duì)哮喘疾病的診斷和治療有重要意義。

［1］Vercelli D.Genetics and biology of asthma 2010：La’ci darem la mano…［J］.J Allergy Clin immunol，2010，125（2）：347－348.

［2］Park HW，Lee JE，Kim SH，et al.Genetic variation of ILl3as a risk factor of reduced lung function in children and adolescents：A cross－sectional populationbased study in Korea［J］.Respir Med，2009，103（2）：284－288.

［3］Kim HB，Kang MJ，Lee SY，et al.Combined effect of tumour necrosis factor－alpha and interleukin－13polymorphisms on bronchial hyperresponsiveness in Korean children with asthma［J］.Clin Exp Allergy，2008，38（5）：774－780.

［4］中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組，中華醫(yī)學(xué)會(huì)全科醫(yī)學(xué)分會(huì).中國(guó)支氣管哮喘防治指南：基層版［S］.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2013，36（5）：331－336.

［5］Graves PE，Kabesch M，Halonen M，et al.A cluster of seven tightly linked polymorphisms in the IL－13 gene is associated with total serum IgE levels in three populations of white children［J］.J Allergy Clin Immunol，2000，105（3）：506－513.

［6］Giuberqia V，Gravina LP，Castanos C，et al.Influence of beta2－adrenoceptor polymorphisms on the response to chronic use of albuterol in asthmatic children［J］.Pediatr Pulmonol，2008，43（5）：421－425.

［7］魏明，佘紅純，李素娟.白細(xì)胞介素IL－13基因多態(tài)性與哮喘易感的關(guān)系［J］.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2007，14（3）：329－330.

［8］舒磊.IL－13基因多態(tài)性位點(diǎn)rs20541和rs1800925單核苷酸多態(tài)性與兒童支氣管哮喘關(guān)聯(lián)性的研究［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，22（4）：254－255.

［9］馮丹.哮喘患者及其一級(jí)親屬IL－13基因多態(tài)性的研究［J］.黑龍江醫(yī)學(xué)，2009，33（7）：481－482.

［10］丁寶棟，管立學(xué)，李海波，等.IL－13＋2044GA 多態(tài)性與兒童支氣管哮喘關(guān)聯(lián)性研究［J］.濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35（5）：331－333.

［11］Liu Q，Hua L，F(xiàn)ang D，et al.Interleukin－13and RANTES polymorphisms in relation to asthma in children of Chinese Han nationality［J］.Asian Pac J Allergy Immunol，2013，31（3）：247－252.

［12］Li X，Zhang Y，Zhang J，et al.Asthma susceptible genes in Chinese population：a meta－analysis［J］.Respir Res，2010，11：129.

［13］Yang H，Dong H，Dai Y，et al.Association of interleukin－13 C－1112T and G ＋2044A polymorphisms with asthma：a meta－analysis［J］.Respirology，2011，16（7）：1127－1135.

［14］Nie W，Liu Y，Bian J，et al.Effects of polymorphisms－1112C／T and ＋2044A／G in interleukin－13 gene on asthma risk：a meta－analysis［J］.PLoS One，2013，8（2）：56－65.

［15］華麗，鮑一笑，呂婕，等.IL－13基因和β2－AR 基因單核苷酸多態(tài)性與兒童哮喘的關(guān)系［J］.臨床兒科雜志，2008，26（1）：30－32.