β3－腎上腺素能受體對心室重塑大鼠鈣調(diào)磷酸神經(jīng)酶信號通路的調(diào)節(jié)及益氣溫陽活血方的干預(yù)作用

楊冬花 顧廣富 羅建華

（1.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院2011級研究生，貴州 貴陽 550002）

研究［1］發(fā)現(xiàn)，β3－腎上腺素能受體（β3－AR）對心肌細胞Ca2＋的調(diào)控可能是其在衰竭心臟發(fā)揮作用的重要機制，鈣調(diào)磷酸神經(jīng)酶（CaN）作為細胞內(nèi)Ca2＋敏感的信號物質(zhì)，在心室重塑的發(fā)展中起重要作用［2］。前期工作發(fā)現(xiàn)益氣溫陽活血方通過影響心力衰竭大鼠血漿尾加壓素Ⅱ、內(nèi)皮素－1和腎上腺髓質(zhì)素水平，防止心室重塑，改善心臟功能［3］，但是否通過β3－AR 調(diào)節(jié)CaN 信號通路抑制心室重塑，目前尚不清楚。本研究通過觀察β3－AR 對心室重塑大鼠CaN 信號通路的調(diào)節(jié)及益氣溫陽活血方的干預(yù)研究，為進一步臨床運用提供理論依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 材料（1）實驗動物：健康Wistar雄性大鼠40只，清潔級，鼠齡5～6個月，體質(zhì)量（250±10）g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，合格證號：SYSK（黔）2002－0001。（2）益氣溫陽活血方主要成分：人參、黃芪、丹參、益母草各30g，白術(shù)、茯苓各15g，桂枝9g等11味中藥。藥材予貴州省人民醫(yī)院中藥房一次性選購，煎藥濾渣取汁在水浴中濃縮至每毫升煎液含生藥4g，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 ISO（Sigma公司），卡維地洛（齊魯制藥有限公司，批號：H20000100），Trizol（Invitroge公司），引物由上海生物工程公司合成，大鼠抗人β3－AR 抗體（Abcam 公司），兔抗人CaN 抗體及兔 抗 人NFAT3抗體（Santa Crus公司），NFAT3核蛋白提取 試劑盒（EPIGENTEK組公組司），NFAT3組核組蛋組白組活性檢測試劑盒（Active Motif公司），ECL 顯影試劑盒（Santa Cruz公司）。

1.3 方法（1）心力衰竭的模型制備［4］：采用異丙腎上腺素腹腔注射［3mg／（kg·d）］誘導(dǎo)慢性心力衰竭模型。（2）動物分組及治療：選用Wistar雄性大鼠，隨機分為正常組、模型組、中藥組（益氣溫陽活血方治療組）、西藥組（卡維地洛治療組），每組10只，實驗開始中藥組和西藥組分別予益氣溫陽活血方（8mL／kg）和卡維地洛［50mg／（kg·8mL）蒸餾水］灌胃治療，每日2次。正常組及對照組以蒸餾水等量灌胃，共8周。試驗結(jié)束后麻醉測量心臟結(jié)構(gòu)和功能，抽取血漿，然后處死動物，留取心臟組織，置于－70 ℃低溫冰箱中冷凍保存，以檢測其他指標(biāo)。（3）心臟結(jié)構(gòu)及功能測定：對各組大鼠實驗結(jié)束后以Agilent SONOS 5500超聲儀對大鼠行超聲心動圖檢查。分別測量左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左室收縮末期內(nèi)經(jīng)（LVDs）、左室后壁厚度（LVPW）、室間隔厚度（IVS），推算射血分?jǐn)?shù)（EF%值）。EF%=（LVDd－LVDs）／左室舒張末內(nèi)徑×100%。（4）心肌組織β3－AR、CaN及NFAT3mRNA 的表達：β3－AR（444bp）上游5′－AGTGGG ACTCCTCGTAATG－3′，下 游5′－CGCTTAGCTACGACGAAC－3′。CaN（339 bp）：上 游5′CTTTCAACCAC CTCTTCGG 3′，下游5′GCTCCATCAGCTTCA CTACCTGTCC 3′；NFAT3組引組物（382組bp）：sense：5′CTACAGCAGCGTCCAGAGC 3′，antisense：5′TAGCCAACAACACCCCCACTCCCAC 3′。GAPDH（187 bp）：上 游5′－GACAACGGCTCCGGCATGTG－3′，下游5′－TGAGGATGCCTCTCTTGC－3′。按Trizol試劑說明書提取左室心肌組織總RNA，參照第一鏈cDNA 合成試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進行PCR反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物5μL進行瓊脂糖凝膠電泳、照相，利用UVP凝膠掃描儀測定條帶的吸光度（A）值，以目的基因與GAPDH 條帶的吸光度（A）值的比值代表其表達的相對量。（5）心肌組織β3－AR、CaN及NFAT3蛋白質(zhì)的表達：提取左心室組織蛋白質(zhì)，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。一抗?jié)舛染鶠?∶1 000，二抗?jié)舛葹?∶2 000，化學(xué)發(fā)光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統(tǒng)進行密度掃描并分析。（6）NFAT3核蛋白活性檢測 無菌條件下取左心室肌組織，碾磨勻漿以備提取核蛋白，核蛋白提取實驗步驟及核因子活性實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心臟結(jié)構(gòu)及功能的測定 與正常組比較，模型組大鼠心臟IVS 及LVPW 厚度均增厚，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而EF%值與正常組比較，模型組大鼠則明顯降低（P＜0.05）。中藥組、西藥組大鼠IVS、LVPW 及EF%值與正常組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組心臟結(jié)構(gòu)及功能的檢測（±s）

表1 各組心臟結(jié)構(gòu)及功能的檢測（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

2.2 各組心肌組織β3－AR、CaN 及NFAT3mRNA的表達水平檢測 模型組大鼠心肌組織β3－AR、CaN 及NFAT3mRNA 的表達水平與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。中藥組、西藥組心肌組織β3－AR、CaN及NFAT3mRNA 的表達水平與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組心肌組織β3－AR、CaN 及NFAT3mRNA 的表達水平（±s）

表2 各組心肌組織β3－AR、CaN 及NFAT3mRNA 的表達水平（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

2.3 各組心肌組織β3－AR、CaN 和NFAT3蛋白質(zhì)的表達水平及NFAT3 核蛋白活性檢測 模型組大鼠心肌組織β3－AR、CaN 和NFAT3蛋白質(zhì)的表達水平及NFAT3 核蛋白活性與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。中藥組、西藥組心肌組織β3－AR、CaN、NFAT3蛋白質(zhì)的表達水平及NFAT3 核蛋白活性與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組心肌組織β3－AR、CaN、NFAT3蛋白質(zhì)的表達水平及NFAT3 核蛋白活性（±s）

表3 各組心肌組織β3－AR、CaN、NFAT3蛋白質(zhì)的表達水平及NFAT3 核蛋白活性（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

3 討論

β3－AR 是繼β1－AR、β2－AR 后發(fā)現(xiàn)的又一β腎上腺素受體，在心力衰竭時隨兒茶酚胺濃度升高、去甲腎上腺素的釋放，β3－AR 被激活，β3－AR 持續(xù)增多將引起放大效應(yīng)，產(chǎn)生持續(xù)的負性肌力作用，導(dǎo)致進一步心室重構(gòu)，惡化心功能［5］。

Ca2＋是心肌細胞最重要的第二信使，當(dāng)心肌細胞受到機械牽張、負荷增加或神經(jīng)體液因素的刺激時，胞內(nèi)Ca2＋濃度出現(xiàn)反應(yīng)性增加，進而通過調(diào)節(jié)下游因子誘導(dǎo)心室重塑的發(fā)生發(fā)展［6］。β3－AR 對心肌細胞Ca2＋的調(diào)控可能是其在心室重構(gòu)中發(fā)揮作用的重要機制。

CaN 受Ca2＋信號調(diào)控而發(fā)揮多種生物功能，而CaN 自身不但是多條信號傳導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)，而且還可通過去磷酸化作用使Ca2＋信號和其他調(diào)節(jié)機制偶聯(lián)起來，進而對其他信號通路進行調(diào)節(jié)，是細胞在信號調(diào)控與信號傳遞中的效應(yīng)酶和調(diào)節(jié)酶［7］。NFAT3核蛋白活性依賴于胞漿中鈣離子轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)的流量，胞漿內(nèi)鈣離子的增加激活鈣調(diào)蛋白，進而激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，使胞質(zhì)中的NFAT3去磷酸化進入細胞核，NFAT3核蛋白活性增加，調(diào)節(jié)下游心肌肥大相關(guān)基因，如腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素－1、血管緊張素Ⅱ等的表達促進心室重塑［8］。

本研究結(jié)果顯示，以異丙腎上腺素造模后，模型大鼠出現(xiàn)LVPW 及腦明顯增厚，而EF%值下降。上述慢性心衰大鼠的相關(guān)數(shù)據(jù)與人的慢性心力衰竭心室重塑出現(xiàn)心肌收縮力下降、心室肥厚的相似，提示造模成功。而且模型大鼠在出現(xiàn)LVPW 及IVS明顯增厚、EF%值下降的同時，伴隨β3－AR、CaN、NFAT3mRNA 和蛋白質(zhì)的表達水平以及NFAT3核蛋白活性明顯升高。我們推測，心力衰竭時交感－腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)激活，β3－AR 持續(xù)興奮，導(dǎo)致心肌細胞［Ca2＋］i增加，而心肌細胞［Ca2＋］i增加，激活CaN 使NFAT3去磷酸化并進入胞核，NFAT3核蛋白活性增加，活化下游多種心肌肥厚的相關(guān)基因。提示β3－AR 可通過調(diào)控CaN－NFAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)慢性心力衰竭心室重塑的病理生理過程。

卡維地洛是一種具有多種附加作用的第三代β受體阻滯藥，是非選擇性地阻滯β受體及選擇性地阻滯α1受體，大規(guī)模臨床實驗證實可抑制慢性心力衰竭心室重塑。本研究結(jié)果顯示，益氣溫陽活血方與卡維地洛一樣，可以抑制β3－AR、CaN、NFAT3 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達水平以及NFAT3 核蛋白活性，改善心力衰竭大鼠心臟功能，提高EF%值逆轉(zhuǎn)IVS及LVPW 厚度，防止心室重塑。故初步推論心力衰竭時，益氣溫陽活血方通過抑制心臟的局部RAAS 系統(tǒng)，阻斷心力衰竭時過分激活的β3－AR，從而抑制CaN 信號通路逆轉(zhuǎn)心室重塑，具體作用機制有待于進一步研究證實。

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