基因工程技術(shù)在牡丹研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望

霍瑾茹

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

牡丹（Paeonia suffruticosa），又名富貴花、百兩金、木芍藥、鼠姑、鹿韭，為芍藥科芍藥屬多年生灌木植物，是一種原產(chǎn)于中國(guó)西部秦嶺和大巴山一帶山區(qū)的傳統(tǒng)名花，享有“花王”的美譽(yù)。我國(guó)既是牡丹野生種的原產(chǎn)中心和分布中心，又是牡丹園藝品種的栽培中心，擁有四大品種群系。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，基因工程技術(shù)在牡丹上也得到了較為廣泛的應(yīng)用。

1 分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹親緣鑒定上的應(yīng)用

我國(guó)具有極為豐富的牡丹資源，據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，全國(guó)僅栽培的牡丹品種就達(dá)800個(gè)以上。由于牡丹異花授粉的特性，種間極易雜交，以及長(zhǎng)期引種、選擇的結(jié)果，已很難單從植物的外部形態(tài)上來(lái)確定品種的來(lái)源、名稱和品種間的親緣關(guān)系，常出現(xiàn)同名異種或同種異名的問(wèn)題，這些都給準(zhǔn)確進(jìn)行牡丹品種資源的篩選、鑒定和利用帶來(lái)了困難。關(guān)于牡丹品種鑒定，過(guò)去幾十年里，研究者在形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方面做了大量工作。近些年來(lái)，許多學(xué)者在DNA水平上深入研究牡丹種間、種與品種間及品種群間的相互關(guān)系，揭示出形態(tài)學(xué)無(wú)法分析解決的方面。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，迅速建立起我國(guó)牡丹品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)種質(zhì)資源的快速鑒別、種質(zhì)資源知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)、園藝植物國(guó)際登錄、分子標(biāo)記育種和優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)新等方面將發(fā)揮重要作用。

1.1 RAPD技術(shù)

利用RAPD技術(shù)，陳向明等對(duì)35個(gè)不同花色牡丹品種親緣關(guān)系進(jìn)行分析，認(rèn)為來(lái)源相同、花色相同的品種間親緣關(guān)系相對(duì)較近，但多數(shù)遺傳組的劃分與花色系列間并未有一致的關(guān)系；Hosoki等對(duì)19個(gè)牡丹品種親緣關(guān)系進(jìn)行分析，得出遺傳聚類組的劃分與花色并不完全一致。孟麗等對(duì)11個(gè)牡丹野生類群和12個(gè)栽培品種親緣關(guān)系進(jìn)行分析，認(rèn)為與栽培牡丹間親緣關(guān)系從近到遠(yuǎn)依次為楊山牡丹、四川牡丹、卵葉牡丹、紫斑牡丹和矮牡丹，RAPD試驗(yàn)擴(kuò)增出的25個(gè)特異標(biāo)記可用于牡丹組內(nèi)種間、品種間的分類與鑒定。鄒喻蘋(píng)等利用RAPD標(biāo)記分析了牡丹組種內(nèi)與種間遺傳關(guān)系，結(jié)果與洪德元根據(jù)形態(tài)性狀對(duì)該組所做的分類處理基本相符。

1.2 AFLP技術(shù)

AFLP（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）作為一種分子標(biāo)記因其具有帶型豐富、用樣量少、靈敏度高、快速高效等特點(diǎn)，已被用于檢測(cè)遺傳多樣性、構(gòu)建遺傳圖譜和定位克隆基因、天然居群的遺傳結(jié)構(gòu)與保護(hù)生物學(xué)研究等方面，成為材料間遺傳多樣性和分類研究的有效手段。袁濤對(duì)牡丹7個(gè)野生種和32個(gè)品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系A(chǔ)FLP分析結(jié)果顯示，野生種的遺傳多樣性明顯高于品種的遺傳多樣性。但是，四川牡丹沒(méi)有參與中國(guó)栽培牡丹品種群的起源與演化，完全與孟麗的結(jié)論不一致。因此，四川牡丹在栽培牡丹品種群的起源與演化中的地位尚不清楚.侯小改發(fā)現(xiàn)與革質(zhì)花盤(pán)亞組與栽培牡丹親緣關(guān)系從近到遠(yuǎn)的4個(gè)種依次為：楊山牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹和卵葉牡丹，且矮牡丹和卵葉牡丹有較近的親緣關(guān)系，但缺乏四川牡丹。侯小改將30個(gè)牡丹品種完全區(qū)分開(kāi)，多數(shù)選育地相同的牡丹種質(zhì)表現(xiàn)出較為密切的親緣關(guān)系。當(dāng)其他性狀相差不大時(shí)，株高相近的品種間親緣關(guān)系相對(duì)較近。李保印等利用AFLP技術(shù)對(duì)中原牡丹品種建立了由60個(gè)樣本組成的核心種質(zhì)。

1.3 SRAP技術(shù)

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）是一種新型的基于PCR的標(biāo)記方法，由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros提出。該標(biāo)記通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)可讀框（open reading frames，ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增，因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記將AFLP和RAPD兩者的優(yōu)點(diǎn)有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)。SRAP標(biāo)記是對(duì)基因的重要組成部分ORFs進(jìn)行擴(kuò)增，基因的多樣性更能反映遺傳資源的多樣性，SRAP標(biāo)記在這方面的應(yīng)用較為廣泛。

HAO等對(duì)29個(gè)品種的牡丹進(jìn)行研究表明，SRAP標(biāo)記是非常有效的識(shí)別牡丹品種和雜交種的標(biāo)記方法。其鑒定結(jié)果與形態(tài)觀察的結(jié)果一致，且操作簡(jiǎn)便，可大大降低引物合成費(fèi)用，提高引物的使用效率。郭大龍等對(duì)影響牡丹SRAP反應(yīng)的各因子進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到牡丹最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，為SRAP技術(shù)在牡丹育種上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2 基因工程技術(shù)在控制牡丹種質(zhì)創(chuàng)新上的應(yīng)用

牡丹的花期較短，且花期較集中，給牡丹花會(huì)的舉辦和人們賞花帶來(lái)不便，如何延長(zhǎng)牡丹花期成為迫切需要解決的問(wèn)題。牡丹花屬乙烯敏感型，乙烯的大量產(chǎn)生是牡丹花衰老的主要原因。在高等植物體內(nèi)乙烯的生物合成是由前體物質(zhì)SAM（S一腺苷甲硫氨酸）在ACS（ACC合成酶）和ACO（ACC氧化酶）的催化下形成的，ACS和ACO是乙烯生物合成過(guò)程中的2個(gè)關(guān)鍵酶。通過(guò)ACC氧化酶的反義基因技術(shù)，可望有效抑制乙烯生成，從而延長(zhǎng)牡丹花期。楊英軍等通過(guò)PCR擴(kuò)增，已獲得長(zhǎng)度約500 bp的片段，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)該片段與已知序列同源性為98.2%，表明牡丹ACC氧化酶基因部分序列克隆成功。進(jìn)一步將克隆到的牡丹ACC氧化酶片段與植物表達(dá)載體pBI 121反向連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，成功構(gòu)建了牡丹ACC氧化酶基因的反義表達(dá)載體，為進(jìn)一步通過(guò)反義技術(shù)獲得抗衰牡丹資源奠定了基礎(chǔ)。

3 展 望

基因工程技術(shù)在牡丹研究中的應(yīng)用已取得了較大進(jìn)展，但廣度和深度還有待擴(kuò)大。國(guó)內(nèi)牡丹分子水平的研究主要集中在品種間親緣關(guān)系的研究，在農(nóng)作物育種及轉(zhuǎn)基因花卉方面的研究及應(yīng)用尚處在起步階段。

傳統(tǒng)的育種手段已遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了人們對(duì)于牡丹色、香、花期等的新品種需求。由于牡丹組織再生及組培苗馴化存在諸多困難，目前尚無(wú)法運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍轉(zhuǎn)化法進(jìn)行牡丹轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。

自1987年Meyer獲得轉(zhuǎn)基因矮牽牛以來(lái)，花卉基因工程迅速發(fā)展，并已成為花卉育種的新趨勢(shì).花卉基因工程通過(guò)抑制內(nèi)源基因或?qū)送庠椿蚨ㄏ蚋脑焯囟ㄐ誀钋也粏适г行誀睿蟠罂s短了新品種選育的時(shí)間；而且可以突破種間不親和的限制，將目的基因引入原來(lái)沒(méi)有這種基因的物種，從而極大地改良花卉品質(zhì)，甚至創(chuàng)造新品種。

近年來(lái)發(fā)展的花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)避開(kāi)了再生的障礙且操作簡(jiǎn)單，已在小麥、大豆等作物上獲得成功?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟為牡丹性狀的分子改良提供了一條全新的思路?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD(zhuǎn)基因技術(shù)是現(xiàn)階段一種潛在的適宜于牡丹的轉(zhuǎn)基因方法?；ǚ酃芡ǖ涝诨ㄖ械男纬墒沁M(jìn)行花粉管通道法轉(zhuǎn)基因的前提。花粉管在花柱中的生長(zhǎng)速度因植物種類的不同而差異很大，明確牡丹花粉管形成所需時(shí)間，對(duì)于牡丹花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究是十分必要的。

[1] 張桂榮.中原牡丹種質(zhì)資源的收集與評(píng)價(jià)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（23）：9965-9966.

[2] 郭晨瑛，鄭艷偉，范義榮. 江南牡丹花期調(diào)控試驗(yàn)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（8）：3988-3990.

[3] ZOU Y P，CAI M L，WANG Z P.Systematic studies on Paeonia sect.Moutan DC.Based on RAPD analysis[J].Acta Phytotaxonomica Sinica，1999，37（3）：220-227.

[4] 仇 碩，趙 健，張翠萍. 中國(guó)野牡丹科觀賞植物種質(zhì)資源的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（22）：9471-9472，9519.

[5] 楊英軍，劉保國(guó)，盧軍剛，等. 牡丹ACC氧化酶基因的克隆與反義載體的構(gòu)建[J]. 北方園藝，2008，（5）：187-190.

[6]王燕青，季孔庶. 利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化牡丹SRAP-PCR反應(yīng)體系[J]. 分子植物育種，2009，7（1）：199-203.

[7] 郭大龍， 侯小改， 張 靜，等. 牡丹SRAP反應(yīng)體系的建立及正交設(shè)計(jì)優(yōu)化[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，（12）：113.

[8] 陳向明，鄭國(guó)生，孟 麗. 不同花色牡丹品種親緣關(guān)系的RAPD-PCR分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2002， 35：546-551.

[9] Hosoki T， Kimura D， Hasegawa R， et al. Comparative study of Chinese tree peonycultivars by random amplif i ed polymorphic DNA （RAPD）analysis.Scientia Horticulturae， 1997，（70）：67-72.

[10] 孟 麗，鄭國(guó)生. 部分野生與栽培牡丹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的RAPD研究[J].林業(yè)科學(xué)，2004，40（5）：111-115.

[11] 鄒喻蘋(píng)， 蔡美琳， 王子平. 芍藥屬牡丹組的系統(tǒng)學(xué)研究——基于RAPD分析[J]. 植物分類學(xué)報(bào)，1999，37：220-227.

[12]Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers[J].Theor Appl Genet，2003，107：271- 282.

[13]李保印. 中原牡丹品種遺傳多樣性與核心種質(zhì)構(gòu)建研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2007.

[14]侯小改，尹偉倫，李嘉玨，等. 部分牡丹品種遺傳多樣性的AFLP分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（8）：1709-1715.

[15]Tomkins J P， Wood T C， Barnes L S， Westman A， Wing R A.Evaluation of genetic variation in the daylily（Hemerocallis spp.）using AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics， 2001， 102：489-496.

[16]Koopman W J M， Zevenbergen M J，Van Den Berg R G. Species r e l a t i o n s h i p s i n L a c t u c a S.L.（Lactuceae，Asteraceae）inferred from AFLP fingerprints.American Journal of Botany， 2001，88：1881-1887.

[17]袁 濤. 中國(guó)牡丹部分種與品種（群）親緣關(guān)系的研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，1998.

[18]侯小改，尹偉倫，李嘉玨，等. 牡丹矮化品種親緣關(guān)系的AFLP分析[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2006， 28（5）：73-77.