幾種復(fù)合天然多酚氧化酶氧化茶多酚的比較研究

羅玲，王洪新*，2，胡倩倩，婁在祥，馬朝陽

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫 214122）

幾種復(fù)合天然多酚氧化酶氧化茶多酚的比較研究

羅玲1，王洪新*1，2，胡倩倩1，婁在祥1，馬朝陽1

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫 214122）

以同一批次茶多酚為原材料，以梨PPO作為對(duì)照，比較研究梨與土豆、梨與山藥、梨與紅薯、梨與蘋果4種復(fù)合天然PPO氧化茶多酚形成茶黃素的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在同等條件下，5種天然PPO對(duì)茶多酚的氧化程度依次為梨與土豆PPO＞梨PPO＞梨與山藥PPO＞梨與蘋果PPO＞梨與紅薯PPO。其中經(jīng)梨與土豆PPO體外氧化制備的茶黃素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.13%，高于梨PPO單獨(dú)作用時(shí)的76.95%，所以梨與土豆組成的復(fù)合酶氧化茶多酚的效果最優(yōu)。

多酚氧化酶；茶多酚；茶黃素；色度

多酚氧化酶（polyphenol oxidase PPO）又稱兒茶酚氧化酶［1］，它廣泛存在于植物（如土豆、荔枝、水蜜桃、蘋果、蘑菇、馬鈴薯、豆類、甘薯、煙草等）組織中［2-5］，PPO天然狀態(tài)下與內(nèi)囊體膜結(jié)合在一起的，無活性，但將組織勻漿或損傷后酶活被活化，從而表現(xiàn)出活性［6］。茶多酚（tea polyphenols，TP）中的主要成分兒茶素類主要包括表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）［7］。

這4種兒茶素在PPO的作用下氧化縮合形成茶黃素TF1、TF2a、TF2b、TF3，顏色從淡黃色變?yōu)榧t色［8-9］：

EGC+EC→茶黃素（TF1）；

EGCG+EC→茶黃素-3-沒食子酸酯（TF-3-G）；

ECG+EGC→茶黃素-3’-沒食子酸酯（TF-3’-G）；

EGCG+ECG→茶黃素雙沒食子酸酯（TFBG）。

茶黃素（theaflavins，TFs）具有多種藥理功能與保健功效，如降血脂、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗突變、抗癌防癌等［10-13］，某些功能方面甚至優(yōu)于兒茶素［14］，所以其在食品、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域的作用也越來越突出［15］。但是，茶黃素的提純難度較大、性質(zhì)欠穩(wěn)定，并且直接從紅茶中提制茶黃素所得產(chǎn)品純度低、成本高、產(chǎn)能低。因此，為滿足市場(chǎng)對(duì)茶黃素的需求，尋求生產(chǎn)成本更低、生產(chǎn)效率更高的茶黃素生產(chǎn)途徑具有重要意義。作者研究了幾種多酚氧化酶通過體外氧化合成途徑制備茶黃素混合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶多酚：四川富正源生物科技有限公司產(chǎn)品；豐水梨：產(chǎn)自山東煙臺(tái)；紅富士：產(chǎn)自山東棲霞；土豆：產(chǎn)自山東濰坊；紅薯：產(chǎn)自山東壽光；山藥：產(chǎn)自福建龍巖；乙酸乙酯、檸檬酸、檸檬酸鈉等，均為分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)：上海尤尼克柯儀器有限公司產(chǎn)品；安捷倫1260高效液相色譜儀：安捷倫公司產(chǎn)品；發(fā)酵罐：上海百倫生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

取TPH30523-C1批號(hào)的茶多酚10.00 g作為反應(yīng)底物。根據(jù)最佳反應(yīng)條件預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，取梨400.00 g、梨與蘋果（各200.00 g）、梨與土豆（各200.00 g）、梨與紅薯（各200.00 g）、梨與山藥（各200.00 g）5種天然酶，攪拌機(jī)勻漿（1 min）。將底物與酶的混合物置于發(fā)酵罐中，在25℃（室溫）、pH 7.0（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）、通氣量0.6 L/min、攪拌速度300 r/min的條件下反應(yīng)40 min。

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)100℃沸水迅速滅酶（保證反應(yīng)時(shí)間的一致性）。將混合液經(jīng)兩層紗布過濾，濾液經(jīng)等體積乙酸乙酯萃取3次，取上層紅色液體，經(jīng)低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后轉(zhuǎn)入真空干燥箱干燥（40℃，1 h）得到紅色固體粉末。將紅色固體粉碾壓均勻得到均勻的固體粉末，以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 測(cè)定方法

色度值測(cè)定：采用分光光度測(cè)色儀測(cè)定；茶多酚總量的測(cè)定：酒石酸鐵比色法（GB 8313-87）；4種兒茶素和4種茶黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：樣品經(jīng)甲醇溶液溶解過0.45 μm有機(jī)膜，用高效液相色譜法檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物色度值的測(cè)定結(jié)果分析

圖1為5種PPO氧化茶多酚所得產(chǎn)物的色度值變化。圖中a值表示紅綠色值，a值越大，產(chǎn)物越紅。梨與土豆復(fù)合PPO氧化制備的混合物色度值a稍大于梨PPO，高于其余3種PPO酶源制備的茶多酚混合物。此外。與反應(yīng)前的樣品相比，經(jīng)5種PPO酶源氧化制備茶多酚混合物其a值都有所升高，證明所得產(chǎn)物紅色均加深。5種酶源使氧化產(chǎn)物顏色變紅程度依次是梨與土豆PPO＞梨PPO＞梨與山藥PPO＞梨與蘋果PPO＞梨與紅薯PPO。

圖1 產(chǎn)物的色度值Fig.1 Chroma value a of products

2.2 產(chǎn)物吸光值測(cè)定結(jié)果分析

根據(jù)QB 2154-95要求建立相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

用酒石酸亞鐵分光光度法，在λ420nm條件下測(cè)定反應(yīng)前后樣品中所含茶多酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其吸光值A(chǔ)及總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1，A值變化趨勢(shì)見圖3。

圖2 沒食子酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ethyl gallate

表1 產(chǎn)物吸光度值A(chǔ)與總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Table 1 Absorbance value A and total phenolic content changes of products

圖35 產(chǎn)物的的吸光值Fig.3 Absorbance value of products

比較結(jié)果（表1、圖3）發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)均下降，其中梨與土豆PPO制備所得產(chǎn)物其總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降最多，梨與紅薯源PPO的下降最少。梨與土豆PPO氧化制備的混合物A值最小，梨PPO和梨與山藥PPO的吸光度值（A）相當(dāng)。梨與蘋果PPO和梨與紅薯PPO的吸光值相當(dāng)。此外，與反應(yīng)前的樣品相比，經(jīng)5種PPO氧化制備的茶多酚混合物其吸光值都有所下降，證明所得產(chǎn)物中茶多酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于反應(yīng)前的樣品。5種酶源使氧化產(chǎn)物的吸光值減小程度依次為梨與土豆PPO＞梨PPO＞梨與山藥PPO＞梨與蘋果PPO＞梨與紅薯PPO。與高精度測(cè)色儀測(cè)定結(jié)果顏色加深程度呈相反趨勢(shì)。

2.3 產(chǎn)物中4種兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果

2.3.1 4種兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果根據(jù)測(cè)得樣品的峰面積數(shù)據(jù)，采用外標(biāo)法，按照cx=cr*Ax/Ar公式其中：cx為樣品質(zhì)量濃度；cr為對(duì)照質(zhì)量濃度；Ax為樣品峰面積；Ar為對(duì)照峰面積。

計(jì)算出5種酶制備所得產(chǎn)物中4種兒茶素的質(zhì)量濃度值見表2。

表2 4種兒茶素的質(zhì)量濃度Table 2 Content of four kinds of catechin（mg/mL）

按照公式r（%）=（r為轉(zhuǎn)化率百分比，c0為反應(yīng)前標(biāo)準(zhǔn)組分品濃度，cx為反應(yīng)所得產(chǎn)物相應(yīng)組分濃度）計(jì)算出4種兒茶素的轉(zhuǎn)化率見表3。

表3 4種兒茶素的轉(zhuǎn)化率Table 3 Transformation of four kinds of catechin（%）

比較結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)梨與土豆PPO氧化制備的混合物轉(zhuǎn)化率最高達(dá)46.58%，且高于梨PPO單獨(dú)作用時(shí)的45.70%；其中梨與土豆PPO對(duì)EGCG的轉(zhuǎn)化程度明顯高于梨源PPO，證明梨與土豆PPO之間可能存在某種協(xié)同作用使得其作用能力高于梨PPO單獨(dú)的作用能力；梨、山藥PPO對(duì)4種兒茶素的轉(zhuǎn)化程度最為平均且對(duì)ECG的轉(zhuǎn)化率明顯高于其余4組；梨與蘋果PPO及梨與紅薯PPO對(duì)ECG的轉(zhuǎn)化率都很低，但是梨與紅薯PPO對(duì)EGC的轉(zhuǎn)化效率高于其余4組，說明紅薯PPO對(duì)EGC的轉(zhuǎn)化能力高于其余酶源的PPO。5種酶制得產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率從高到低依次是梨與土豆PPO＞梨PPO＞梨與山藥PPO＞梨與蘋果PPO＞梨與紅薯PPO。利用SPSS對(duì)各組兒茶素轉(zhuǎn)化率進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果顯示P最大值為0.041（P＜0.05），存在差異顯著性。

2.3.2 4種茶黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果同樣根據(jù)峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算公式，計(jì)算出茶黃素相應(yīng)組分的質(zhì)量濃度見表4。

表4 產(chǎn)物中4種茶黃素的質(zhì)量濃度Table 4 Content of four kinds of theaflavins in products（μg/mL）

比較表4數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，梨與土豆PPO和梨PPO氧化制備所得產(chǎn)物中，梨與土豆PPO制備所得茶黃素質(zhì)量濃度最高為343.00 μg/mL，梨PPO制得產(chǎn)物中茶黃素質(zhì)量濃度為325.26 μg/mL。這兩組產(chǎn)物中茶黃素的質(zhì)量濃度相當(dāng)且是其他組的至少2倍。4種復(fù)合酶氧化茶多酚生成的茶黃素中TF2a、TF3明顯高于TF1和TF3，對(duì)照茶黃素生成途徑以及茶多酚轉(zhuǎn)化率（表3）可知，確實(shí)是EGCG和EC是主要的被氧化的成分。5組產(chǎn)物中5種茶黃素的質(zhì)量濃度多少均呈TF2a＞TF3＞TF2b＞TF1，即4種復(fù)合酶組與梨PPO單獨(dú)作用時(shí)4種茶黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)多少的順序保持一致，說明梨PPO及4種組合酶中，轉(zhuǎn)化茶多酚形成茶黃素起主導(dǎo)作用的是梨PPO，土豆的PPO與梨的PPO之間存在較好的協(xié)同作用，并且根據(jù)數(shù)據(jù)可計(jì)算出，土豆PPO對(duì)梨PPO轉(zhuǎn)化茶多酚的協(xié)同作用大小依次是TF2b＞TF1＞TF2a＞TF3。綜上幾種復(fù)合酶對(duì)茶多酚的氧化效果梨與土豆組合是最優(yōu)選，且兩者協(xié)同作用時(shí)TF2b的轉(zhuǎn)化率明顯升高。

2.3.3 產(chǎn)物中茶黃素占總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算結(jié)果經(jīng)梨與土豆天然PPO體外氧化途徑制備的茶黃素，其占總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)88.13%，高于梨PPO單獨(dú)作用時(shí)制備所得產(chǎn)物的76.95%。梨與山藥、蘋果、紅薯組成的復(fù)合酶體外氧化制備茶黃素的能力較低，有鑒于此，在以后的生產(chǎn)中選擇梨與土作為PPO酶源，體外氧化茶多酚制備茶黃素可得到茶黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的產(chǎn)品。

3 結(jié)語

綜上所述，以上5種天然多酚氧化酶在一定條件下可氧化茶多酚制得含一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)茶黃素的混合物，顏色變紅；5種酶源使氧化產(chǎn)物顏色變紅程度依次是梨與土豆PPO＞梨PPO＞梨與山藥PPO＞梨與蘋果PPO＞梨與紅薯PPO。隨著氧化消耗茶多酚，茶多酚總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)不同程度的降低，梨與土豆PPO試驗(yàn)組總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少程度最大。高效液相色譜法檢測(cè)兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化顯示，梨與土豆PPO氧化制備的混合物轉(zhuǎn)化率最高達(dá)46.58%，且高于梨PPO單獨(dú)作用時(shí)的45.70%；猜測(cè)因梨與土豆PPO對(duì)氧化兒茶素各組分間存在某種協(xié)同作用，所以在同等實(shí)驗(yàn)條件下，梨與土豆PPO氧化制得產(chǎn)物中茶黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)88.13.95%，且高于梨PPO單獨(dú)作用時(shí)的76.85%。5種酶源制得的產(chǎn)物中茶黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)從高到低依次是梨與土豆PPO＞梨PPO＞梨與山藥PPO＞梨與蘋果PPO＞梨與紅薯PPO。梨與土豆組合是最優(yōu)選，且兩者協(xié)同作用時(shí)TF2b的轉(zhuǎn)化率明顯升高。

此外，土豆市售價(jià)格是梨的一半，該復(fù)合酶的使用可大大降低茶黃素生產(chǎn)成本，因此在今后的茶黃素生產(chǎn)中可將梨與土豆PPO組合酶作為優(yōu)選酶，對(duì)于尋求價(jià)格低廉的天然酶源，降低茶黃素生產(chǎn)成本具有一定意義。

［1］鄔顯章.酶的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)［M］.吉林:吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1988.

［2］劉春麗，楊躍寰，陳欲云.荔枝果肉多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）:646-648.

LIU Chunli，YANG Yuehuan，CHEN Yuyun.Study on enzymatic characteristics of polyphenol oxidase（PPO）in litchi pulp［J］. Journal of Anhui Agri.Sci.，2011，39（2）:646-648.（in Chineses）

［3］劉亮，曹少謙，陳偉等.脈沖強(qiáng)光及紫外線對(duì)水蜜桃多酚氧化酶活性的影響［J］.農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，28（1）:85-90.

LIU Liang，CAO Shao-qian，CHEN Wei，et al.Effects of pulsed light and ultraviolet-C irradiation on the activity of polyphenol oxidase from honey peach［J］.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2014，28（1）:85-90.（in Chineses）

［4］劉樹興，王樂.蘋果多酚氧化酶特性及無硫護(hù)色脫水研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（3）:334-336.

LIU Shuxing，WANG Le.Characteristics of polyphenol oxidase in apple and non-sulfur prevention of discoloration in dried apple slice processing［J］.Science and Technology of Food Industry，2011，32（3）:334-336.（in Chineses）

［5］周春梅，王欣，王俊城等.白玉菇多酚氧化酶的酶學(xué)特性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（5）:5-9.

ZHOU Chunmei，WANG Xin，Wang Juncheng et al.Study on the characteristics of polyphenol oxidase（PPO）in white hypsizygus marmoreus［J］.Food and Fermentation Industries，2010，36（5）:5-9.（in Chineses）

［6］Tolbert N E.Activation of polyphenol oxidase of chloroplasts［J］.Plant physiology，1973，51（2）:234-244.

［7］宛曉春.茶葉生物化學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［8］金恩惠，吳媛媛，屠幼英.茶黃素抑菌作用的研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2011，11（6）:108-112.

Kim Eun Hye，Wu Yuanyuan，Tu Youying.Study on antibacterial effect of theaflavins［J］.Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2011，1（6）:108-112.（in Chineses）

［9］劉偉，周潔，龔正禮.茶黃素的功能活性研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2013，34（11）:386-391.

LIU Wei，ZHOU Jie，GONG Zheng-li.Research progress in functional activity of theaflavins［J］.Food Science，2013，34（11）:386-391.（in Chineses）

［10］李大祥，宛曉春，楊昌軍等.茶兒茶素氧化機(jī)理［J］.天然產(chǎn)物研究與開，2006，18:171-181.

LI Daxiang，WAN Xiaochun，YANG Changjun et al.Oxidation mechanism of tea catechins［J］.Nat Prod Res Dev，2006，18:171-181.（in Chineses）

［11］杜棋珍，江和源.茶色素的藥理及其應(yīng)用［J］.中國茶葉，1997，05:36-37.

DU Qizhen，JIANG Heyuan.The pharmacology and application of tea pigments［J］.China tea，1997，05:36-37.（in Chineses）

［12］Steele VE，Kelloff GJ，Balentine D et al.Comparative chemopreventive mechanisms of green tea，black tea and selected polyphenol extracts measured by in vitro bioassays［J］.Carcinogenesis，2000，21（1）:63-67.（in Chineses）

［13］謝筆鈞，石煌，胡慰望等.綠茶、烏龍茶、紅茶中的主要組分和酚類化合物抑制脂肪氧合酶活性和抗油脂自動(dòng)氧化特性的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1994，6（4）:19-26.

XIE Bijun，HU Weiwang，SHI Huang et al.Antioxidant properties of fractions and polyphenol constituents from green，oolong and black teas［J］.Nat Prod Res Dev，994，6（4）:19-26.（in Chineses）

［14］潼野慶則，今川.茶葉兒茶酚氧化機(jī)制的研究［J］.日本農(nóng)藝化學(xué)會(huì)志，1963，37:417.

Tong Ye Qing Ze，JIN Chuan.Study on the oxidation mechanism of tea catechins［J］.Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan，1963，37:417.（in Japanese）

［15］魏青，張凌云，張靈枝.酶工程在茶黃素制備上的研究進(jìn)展［J］.福建茶葉，2013，04（4）:02-04.

WEI Qing，ZHANG Lingyun，ZHANg Lingzhi.The advanced progress of enzyme engineering in the preparation of theaflavins［J］. Fujian tea，2013，04（4）:02-04.

A Comparative Study of Several Mixed Natural Polyphenol Oxidases on Oxidizing Tea Polyphenols

LUO Ling1，WANG Hongxin*1，2，HU Qianqian1，LOU Zaixiang1，MA Chaoyang1
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China）

Effects of several mixed natural polyphenol oxidases（PPO）on the transform of tea polyphenols into theaflavins were compared in this paper.Results showed a ranking of pear and potato PPO＞pear PPO＞pear and yam PPO＞pear and apple PPO＞pear and sweet potato PPO for the oxidative activities of five enzyme systems.The pear and potato PPO mixture also led to a higher content of theaflavins（88.13%）than the pear PPO（76.95%）.So the mixed pear and potato PPO system is optimal for the oxidation of tea polyphenols.

polyphenol oxidase，tea polyphenols，theaflavins，chromaticity

Q 946.841

A

1673—1689（2015）04—0385—05

2014-03-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071601）。

*通信作者：王洪新（1964—），男，江蘇徐州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品營養(yǎng)與功能因子研究。E-mail：cnwhx@163.com