南美白對蝦主要過敏原原肌球蛋白的低過敏性處理方法研究

高永艷，陳欽再，郭桂萍，盧瑛*，孫佳益，潘迎捷

（1.上海海洋大學食品學院/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.南通出入境檢驗檢疫局，江蘇南通 226006）

南美白對蝦主要過敏原原肌球蛋白的低過敏性處理方法研究

高永艷1，陳欽再1，郭桂萍2，盧瑛*1，孫佳益1，潘迎捷1

（1.上海海洋大學食品學院/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.南通出入境檢驗檢疫局，江蘇南通 226006）

以南美白對蝦原肌球蛋白（Tropomyosin，Tm）為研究對象，采用酶解法、超聲結(jié)合酶解法消減3種蝦制品中的Tm。首先，以菠蘿蛋白酶水解富集的Tm樣品通過優(yōu)化酶活與底物質(zhì)量比、反應時間和反應溫度，建立了能有效消減Tm的酶解方法；同時對比了酶解、超聲結(jié)合酶解法分別對蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜3種制品中的Tm過敏原性變化情況。Tm致敏動物模型的抗血清ELISA結(jié)果顯示，單純酶解和超聲結(jié)合酶解處理的蝦仁其過敏原性無顯著性差異（P＞0.05）；經(jīng)超聲結(jié)合菠蘿蛋白酶酶解處理后的蝴蝶蝦仁樣品其過敏原性降低了21.05%；而蝦糜樣品中，單純的酶解或超聲結(jié)合酶解法與對照相比均有顯著性差異，其過敏原性分別減少了30.70%和33.33%。綜上所述，作者建立的酶解法可有效消減Tm的過敏原性，該酶解法以及超聲結(jié)合酶解法在低過敏原性蝴蝶蝦仁和蝦糜制品的生產(chǎn)領域具有較高的應用可行性。

低過敏性；原肌球蛋白；消減；菠蘿蛋白酶

隨著生活水平的提高，食物引起的過敏性疾病已成為嚴重的食物安全問題，相關(guān)調(diào)查顯示，約有3%～4%的成人和6%的兒童發(fā)生食物過敏反應［1］。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織公布的8大類主要過敏食品，有兩類屬于水產(chǎn)品，其中一類就是蝦蟹等甲殼類動物及其制品［2］。近年來，食物過敏發(fā)生率呈持續(xù)上升趨勢，但其發(fā)病機制尚不明確［3］，臨床上尚無有效的治療方法，易過敏患者僅能依靠避免或者減少致敏性食物的攝入，從而達到預防過敏的目的。

南美白對蝦在我國的分布較為廣泛，養(yǎng)殖規(guī)模較大，是我國常見的蝦類，因其含有較高的營養(yǎng)成分，氨基酸種類齊全，蛋白質(zhì)含量豐富，具有較高的營養(yǎng)價值［4］，而被消費者青睞。目前，我國對其消費較高，主要產(chǎn)品有冷凍蝦仁、即食蝦仁［5］、蝦丸［6］等，廢棄物［7-8］頭殼也有較高的利用價值。

食品領域中的低過敏性處理方法主要有物理法，生物法等，例如有學者用微波結(jié)合酶解［9］，超高壓［10］等方法處理乳制品來降低其過敏性，用超高壓結(jié)合酶解［11］的方法處理大豆蛋白。原肌球蛋白Tm是甲殼類水產(chǎn)品的主要過敏原物質(zhì)，其相對分子質(zhì)量約為36 000，具有較高的熱穩(wěn)定性和一定的耐消化性。目前較為常見的降低蝦類致敏性的處理方法有酶解法［12-13］、美拉德反應［14］、高壓處理等。也有學者采用輻照［15］、超聲［16］等方法降低蝦的過敏原性。超聲波具有高速、強烈振動和空化效應作用，是一種彈性機械振動波。其傳播時產(chǎn)生的熱效應、機械效應和空化效應，能夠降解生物大分子［10］，引起介質(zhì)的某些變化［17］。蛋白酶的酶解作用主要是使抗原決定簇的三維結(jié)構(gòu)改變，或使化學鍵斷裂導致抗原失去活性從而達到降低其致敏性的作用，也有通過斷裂酰胺鍵，破壞其一級結(jié)構(gòu)而降低其致敏性。有報道用菠蘿蛋白酶酶解蛋清樣品，其蛋清致敏性有較大程度的降低［18］。

作者以南美白對蝦主要過敏原Tm為研究對象，首先優(yōu)化菠蘿蛋白酶對Tm富集樣本的最優(yōu)消減條件［19］，建立了Tm的低過敏性處理方法；進而采用酶解、超聲結(jié)合酶解法分別處理蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜樣品對比分析其過敏原性變化情況，最終探討了低過敏原性蝦制品的有效處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活南美白對蝦：購于浦東新區(qū)果園農(nóng)貿(mào)市場；層析濾紙（3030-861）：德國Whatman公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜（NC）：德國賽多利斯公司產(chǎn)品。菠蘿蛋白酶（B4882-10G），TEMED（0761），DAB顯色液（D0426-50SET）：美國Sigma公司產(chǎn)品；蛋白標準相對分子質(zhì)量Marker（BM523），雙色預染寬相對分子質(zhì)量Marker，牛血清蛋白組分V（BSA），HRP標記的兔抗小鼠抗體IgG（BS392-A）：上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司產(chǎn)品；其他試劑如無特殊說明均為國產(chǎn)分析純。

勻漿機（JYL-C020）：九陽股份有限公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)電泳儀（mini protean 4）：美國BIO-RAD產(chǎn)品；半干式轉(zhuǎn)膜儀（AE-8135）：日本ATTO公司產(chǎn)品；凝膠掃描儀（powerlook 2100XL-USB）：UMAX公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機（Avanti J-26XP）：美國Beckman Coulter產(chǎn)品；超聲波清洗器（SK5200HP）：上海科導超聲儀器有限公司產(chǎn)品；酶標儀：Biotek公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 Tm富集樣品的制備蝦類Tm的富集純化參照蔡秋鳳［20］等的方法，并略作修改。首先將蝦肉制成丙酮粉，再將其分別經(jīng)質(zhì)量分數(shù)35%和55%硫銨濃縮得到Tm富集樣品。Bradford法［21］測定蛋白濃度后，保存于-20℃冰箱中。采用SDS-PAGE和免疫印跡法鑒定Tm的純度，免疫印記一抗為單克隆抗體2A7H6，其對蝦蟹等甲殼類和部分軟體動物的主要過敏原Tm具有特異性反應［22］。

1.2.2 SDS-PAGE和免疫印記SDS-PAGE：參考陳小文等［23］建立的不連續(xù)電泳體系，配制質(zhì)量濃度為12 g/dL的分離膠和5 g/dL的濃縮膠。樣品與上樣緩沖液1:1混勻后，點樣，電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍R-250染色，再經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。免疫印跡：電泳結(jié)束后，采用半干式電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將膜封閉反應1 h，再分別加入一抗2A7H6和二抗（兔抗鼠HRP-IgG，1:5 000）各室溫反應1 h，最后加入DAB顯色液顯色并拍照。

1.2.3 菠蘿蛋白酶酶解條件優(yōu)化將富集的Tm樣品中加入菠蘿蛋白酶酶解液（酶活6 u/mg）中，探討酶解時間、最適酶解溫度以及酶活與底物質(zhì)量比（u/g）3個因素對酶解作用的影響。首先探討不同酶活與Tm質(zhì)量比，分別對比酶活與Tm質(zhì)量比為32.57、21.71、14.47、9.65、6.43、4.29 u/g，在60℃水浴30 min時酶對Tm過敏原活性的酶解作用。再采用溫度60℃、酶活與底物質(zhì)量比為32.57 u/g的條件下分別酶解5、10、15、20、25、30 min，優(yōu)化酶解時間。最后在酶活與底物質(zhì)量比為32.57 u/g的條件下，分別采用酶解溫度為25、30、35、40、45、50、55℃酶解30 min，優(yōu)化酶解溫度。對酶解后的樣品，采用SDS-PAGE及免疫印跡法分析評價酶對過敏原物質(zhì)的影響，以確定最佳的酶處理條件。

1.2.4 蝦制品的低過敏性處理工藝探討去南美白對蝦10～11 g，去除蝦頭，蝦殼，蝦線，用蒸餾水沖洗干凈，置于吸水紙上去除表面水分，稱重（5± 0.03）g，即為蝦仁樣品；將蝦仁沿蝦線剖開呈蝴蝶狀，作者將其命名為蝴蝶蝦仁；用勻漿機將蝦仁絞碎后的蝦樣定義為蝦糜樣品。首先配制優(yōu)化后的酶解液，再將其置于水浴鍋中預熱5 min，再將蝦制品加入其中，60℃水浴，酶解30 min后，取出蝦制品蒸制15 min滅酶活。此外，作者還采用了超聲結(jié)合酶解的方法探討蝦的低過敏性。即先將蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜樣品放入有水的燒杯中，超聲3 min，再加酶解液酶解30 min，其余步驟如前所述。對照樣品：先將酶解液煮沸10 min滅酶活，再酶解蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜樣品，其余步驟如前所述。

1.2.5 蝦制品的過敏原性分析抽提Tm的方法參照Shi liang［24］，并略做修改。經(jīng)低過敏處理的蝦肉與20 mmol/L PBST（pH 7.0，含質(zhì)量分數(shù)0.1% Tween20）體積比1：5混合，勻漿40 s。4℃條件下10 000 g離心20 min，取上清，將其煮沸15 min，立即置于冰上冷卻。4℃條件下10 000 g離心20 min，得上清。一部分上清液進行Tricine-SDS-PAGE電泳，參照Hermann Sch?gger［25］的方法，其中分離膠質(zhì)量濃度為16 g/dL，堆積膠質(zhì)量濃度為4 g/dL。另一部分上清液用碳酸鹽緩沖液以一定比例稀釋后（50 mmolL-1，pH 9.6）100 μL/孔包被，37℃孵育1.5 h，洗滌3次。每孔加200 μL封閉液（PBS+2%BSA）于37℃孵育1 h；洗滌。依次加入抗血清和二抗，抗血清按照1:8 000稀釋（PBS+0.5%BSA），二抗（羊抗鼠HRP-IgG，羊抗鼠HRP-IgE）根據(jù)產(chǎn)品推薦稀釋度稀釋，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗滌。OPD顯色，硫酸終止，測定吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菠蘿蛋白酶對Tm酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 菠蘿蛋白酶與底物質(zhì)量比的優(yōu)化蝦的主要過敏原原肌球蛋白Tm是相對分子質(zhì)量約為3.6×104的蛋白，不同酶活與底物質(zhì)量比條件下處理Tm后SDS-PAGE和免疫印跡結(jié)果如圖1。由圖可知，隨著酶活與底物質(zhì)量比的增加，在相對分子質(zhì)量約為3.4×104和3.6×104處電泳條帶逐漸模糊（圖1（a））。樣本1～5其過敏條帶消減較少，而樣本6的過敏原Tm條帶基本上消失其消減效果較明顯，表明當菠蘿蛋白酶與底物質(zhì)量比為32.57 u/g時對過敏原Tm的消減效果最好。免疫印跡結(jié)果（圖1（b））表明樣本3～6在3.4×104和3.6×104處蛋白對2A7H6抗體具有特異性反應，說明3.4×104和3.6×104處為過敏原蛋白Tm；并且樣本1在3.4×104和3.6×104處無特異性條帶，說明此處沒有免疫反應，該結(jié)果與電泳結(jié)果一致。因此，最優(yōu)的酶活與底物質(zhì)量比為32.57 u/g。在后續(xù)的優(yōu)化實驗中選擇該條件較好。

圖1 不同酶與底物質(zhì)量比對Tm的影響Fig.1The effect of mass ratio between bromelain and substrate on Tm

2.1.2 酶解時間的優(yōu)化在酶解溫度為60℃時，不同酶解時間條件下處理Tm的SDS-PAGE和免疫印跡結(jié)果如圖2所示。從圖中可看出，隨著酶解時間由1 min到30 min的增加，在相對分子質(zhì)量約為34× 103和36×103處電泳條帶逐漸模糊，條帶顏色逐漸變淺（圖2（a）），圖中樣本6過敏原Tm條帶最為模糊，幾乎看不清楚，說明相比之下，該時間點的酶解效果較好。免疫印跡結(jié)果表明（圖2（b）），樣本6在34×103和36×103處無特異性條帶，說明無特異性免疫反應，進而表明Tm消減效果較明顯沒有特異性反應，免疫印跡檢測不出Tm條帶。該結(jié)果與電泳結(jié)果一致。說明菠蘿蛋白酶最佳的酶解時間為30 min，酶解30 min的效果較好，在后續(xù)的實驗中，采用菠蘿蛋白酶酶解30 min較好。

圖2 不同酶解時間對Tm的影響Fig.2The effect of hydrolysis time of bromelain on Tm

2.1.3 酶解溫度的優(yōu)化不同酶解溫度處理Tm的SDS-PAGE和免疫印跡結(jié)果如圖3所示。隨著酶解溫度由25℃到55℃的增加，在相對分子質(zhì)量約為34×103和36×103處電泳條帶與對照組相比基本無變化（圖3），表明酶解溫度在25℃到55℃條件下，菠蘿蛋白酶的酶解作用很微弱，對Tm的消減基本沒有作用，而根據(jù)2.1.2可知，在60℃的條件下處理30 min時的樣品過敏原條帶消減較為顯著，大部分Tm被酶解（圖2（a）），免疫印跡反應也證實了這一條件。由此說明，在相同條件下，當菠蘿蛋白酶酶解溫度設置為60℃時能較明顯的消減過敏原Tm。因此，在后續(xù)的優(yōu)化實驗中選擇菠蘿蛋白酶酶解溫度為60℃，較為合理。

2.2 超聲與酶解結(jié)合處理的不同蝦制品的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果

圖4所示，經(jīng)優(yōu)化條件后的菠蘿蛋白酶酶解處理的不同蝦制品的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果，由圖可知，樣本2的Tm條帶與對照相比，沒有顯著性變化，說明菠蘿蛋白酶對蝦仁樣品的過敏原消減作用較低。樣本3的Tm條帶與對照相比明顯減弱，條帶顏色較淺，有小分子蛋白條帶產(chǎn)生，表明菠蘿蛋白酶對蝴蝶蝦仁樣品的過敏原消減有一定的作用。樣本4的Tm條帶減弱的最為明顯，并且產(chǎn)生小分子蛋白條帶較多，與樣本2和3相比，表明菠蘿蛋白酶對蝦糜樣品的過敏原消減作用較強。樣本5和6的Tm條帶與對照樣本幾乎無顯著差異，表明超聲結(jié)合酶解處理后的蝦仁和蝴蝶蝦仁其Tm基本無消減，而樣本7的Tm條帶最為模糊，并且產(chǎn)生了更多的小分子蛋白條帶，表明超聲結(jié)合酶解處理蝦糜樣品后Tm條帶有較大程度的減弱，超聲結(jié)合酶解處理蝦糜樣本的對其過敏原的消減有較好的作用。

圖3 不同酶解溫度對Tm的影響Fig.3The effect of hydrolysis temperature of bromelain on Tm

圖4 菠蘿蛋白酶處理蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜后的電泳圖Fig.4SDS-PAGE of shrimp meat and butterfly shrimp and minced shrimp hydrolyzed by bromelain

2.3 蝦制品的過敏原性評價

作者構(gòu)建的ELISA檢測方法，利用前期研究的Tm致敏動物模型獲得的針對過敏原Tm的含高濃度的IgE鼠源抗血清和含高濃度IgG的抗血清，利用該抗血清，評價了經(jīng)菠蘿蛋白酶處理后的蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜樣品的過敏原性變化情況，其結(jié)果如表1所示。由表可知，對于蝦仁樣品，采用羊抗鼠IgE-HRP為二抗進行ELISA檢測，對于蝦仁樣本，單純的酶解法、超聲結(jié)合酶解法與對照組相比其OD值都無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜經(jīng)處理后的ELISA檢測結(jié)果（OD值，X±S.D.，n=9）Table 1OD values of tackled shrimp meat and butterfly shrimp and minced shrimp by ELISA（X±S.D.，n=9）

對于蝴蝶蝦仁，單純酶解法與對照組相比沒有明顯差異，而超聲結(jié)合酶解法與對照組相比有極顯著的差異（P＜0.01），其過敏原性降低了21.05%，表明超聲結(jié)合酶解法的處理效果要明顯好于單純酶解法。對于蝦糜樣品，單純的酶解法或超聲結(jié)合酶解法與對照組相比均有顯著性差異，其OD值比對照組分別減少了30.70%和33.33%，說明這兩種處理方法能夠明顯降低蝦糜樣品的過敏原性。比較蝴蝶蝦仁和蝦糜發(fā)現(xiàn)，在相同的處理方式下，單純酶解法處理的蝦糜樣品效果要好于蝴蝶蝦仁，呈極顯著性差異；超聲結(jié)合酶解法處理的蝴蝶蝦仁和蝦糜其過敏原性的降低程度無顯著性差異。綜上所述，作者所建立的超聲結(jié)合酶解法較適用于低過敏性蝴蝶蝦仁和蝦糜的制備。

3 結(jié)語

作者首先以富集的Tm樣本為模式蛋白，探討并建立了有效的消減Tm的酶解處理方法，在此基礎上進一步探討了經(jīng)該方法處理后的蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜制品中的Tm的過敏原性變化情況。結(jié)果表明菠蘿蛋白酶能夠有效消減蝦制品的過敏原性，不同的蝦制品有其不同程度的消減變化，進一步的研究結(jié)果表明酶解法及超聲結(jié)合酶解法對于蝴蝶蝦仁和蝦糜的低過敏性有較強的消減作用，相比于蝦仁樣品消減效果較為顯著，具有較好的應用可行性。作者研究結(jié)果不僅對蝦制品的低過敏性處理方法具有理論指導意義，更為蝦制品的低過敏性工藝提供了實際參考，也為開發(fā)低過敏性蝦產(chǎn)品提供了方法，具有較好的應用性與實際指導意義。

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Studies on the Reduction of the Major Allergen Tropomyosin in Pacific White Shrimp

GAO Yongyan1，CHEN Qinzai1，GUO Guiping2，LU Ying*1，SUN Jiayi1，PAN Yingjie1
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation，Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for AquaticProducts on Storage andPreservation（Shanghai），Ministry of Agriculture，Shanghai 201306，China；2.Nantong Entery-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nantong 226006，China）

The reduction of tropomyosin（Tm），the major allergen in Pacific white shrimp（PenaeusVannamei），wasstudiedusingenzymolysisandthecombinationofultrasound andenzymolysis，respectively.First，the enzymatic hydrolysis of shrimp Tm with bromelain wasoptimized by measuring the effects of changes in enzyme activity/substrate mass ratio，incubation time and temperature of hydrolysis.The changes of Tm allergenicity in peeled prawns，butterfly shrimp and minced shrimp was comparatively studied by three methods of hydrolysis.The antiserum of sensitization animal model for shrimp allergen Tm was detected using enzyme-linkedimmunosorbent assay（ELISA）.The results showed the allergenicity was not significant（P＞0.05）when treated with enzymolysis or combining with ultrasound.The allergenicity of the butterfly shrimp treated by ultrasound and bromelain was reduced to 21.05%，while the allergens of the minced shrimp hydrolyzed using enzymolysis or the combination of ultrasound andenzymolysiswere reduced to 30.70%and 33.33%，respectively.In conclusion，the developed enzymolysis methods，ie.，the enzymolysis and the combination of ultrasound andenzymolysis，can effectively reduce shrimp Tm allergenicity.They have potential applications in producing hypoallergenic shrimp，such as hypoallergenic butterfly shrimp or hypoallergenic minced shrimp.

allergenicity，tropomyosin，reduce，bromelain

Q511

A

1673—1689（2015）04—0413—07

2014-07-14

上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字（2009）第6-1號）；江蘇出入境檢驗檢疫局科研項目（2013kj34）；上海海洋大學大學生創(chuàng)新活動計劃項目（B1-5106-12-0049）；上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心資助項目（11DZ2280300）；上海高校一流學科建設資助項目。

*通訊作者：盧瑛（1971-），女，上海人，副教授，主要從事食物過敏原、食品安全檢測技術(shù)研究。E-mail:y-lu@shou.edu.cn