石榴皮中鞣花酸的抗衰老性能及機(jī)理研究

邢曉平，楊笑笑，，盧婕，曹玉華

（1.鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城 224051；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

石榴皮中鞣花酸的抗衰老性能及機(jī)理研究

邢曉平1，楊笑笑1，2，盧婕2，曹玉華2

（1.鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城 224051；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

利用光譜法研究了石榴皮中鞣花酸的抗衰老性能和機(jī)理。首先，通過(guò)分光光度法考察了鞣花酸對(duì)DPPH·、·OH和·O2-等3種自由基的清除率和彈性蛋白酶抑制率，結(jié)果證明了鞣花酸抗衰老能力強(qiáng)。其次，以彈性蛋白酶為研究對(duì)象，利用光譜法探討了鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的作用機(jī)理。結(jié)果表明，鞣花酸與彈性蛋白酶發(fā)生作用并形成絡(luò)合物，當(dāng)鞣花酸的質(zhì)量濃度為4.57 mg/ mL時(shí)，鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的抑制率高達(dá)88.26%。當(dāng)鞣花酸濃度低于4.0×10-5mol/L時(shí)，其熒光猝滅機(jī)理主要是靜態(tài)猝滅，鞣花酸濃度較高時(shí)動(dòng)態(tài)猝滅所占比例增加。因此，鞣花酸可以作為天然自由基清除劑與彈性蛋白酶抑制劑應(yīng)用于抗衰老化妝品中。

鞣花酸；抗衰老；光譜法

石榴（Punica granatum L）是石榴科石榴屬植物落葉灌木或小喬木，在陜西臨潼、山東棗莊、安徽懷遠(yuǎn)、四川會(huì)理、云南蒙自、新疆葉城等地均有廣泛的種植。石榴皮是石榴的干燥果皮，含有豐富的鞣質(zhì)類化合物，包括鞣花酸、安石榴苷、安石榴林，石榴亭A、石榴亭B等［1］。鞣花酸（Ellagic acid，EA）是石榴皮鞣質(zhì)類化合物中最具代表性的單體，現(xiàn)有的藥理研究顯示鞣花酸具有抗腫瘤、抗氧化、抗突變和抗致癌等活性［2-5］，還具有凝血、降壓、鎮(zhèn)靜等作用［6］。

氧化是皮膚衰老的最大威脅之一，D.Harman率先提出了自由基衰老學(xué)說(shuō)，他認(rèn)為機(jī)體衰老是由于細(xì)胞正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基的有害作用造成的。一般情況下，機(jī)體內(nèi)的自由基的產(chǎn)生與消失是動(dòng)態(tài)平衡的，但是年齡增大、飲食不健康、勞累過(guò)度、精神壓力大等因素都能讓肌膚自由基泛濫，過(guò)剩的自由基會(huì)在皮膚細(xì)胞組織中累積并與細(xì)胞膜內(nèi)含量豐富的脂類物質(zhì)發(fā)生氧化作用，造成生物細(xì)胞膜的損傷，從而產(chǎn)生面色黯淡無(wú)光澤、缺水干燥等氧化現(xiàn)象。因此，過(guò)剩的自由基是造成皮膚衰老的重要因素。

彈性蛋白酶（Elastase）是一種分解不溶性彈性蛋白為特征的蛋白水解酶，主要通過(guò)動(dòng)物胰臟和微生物發(fā)酵獲得［7］，是除了DPPH·、·OH和·O2-等自由基外，對(duì)人體皮膚等產(chǎn)生重要影響的生物活性酶。彈性蛋白酶會(huì)使皮膚真皮中支撐皮膚結(jié)構(gòu)的彈性蛋白被過(guò)度的降解，從而使皮膚產(chǎn)生皺紋、松弛無(wú)彈性等衰老癥狀。鞣花酸作為天然彈性蛋白酶抑制劑，可以有效地抑制彈性蛋白酶的活性，從而起到增強(qiáng)皮膚彈性，減少皺紋及色素沉著，延緩皮膚衰老等作用。

作者通過(guò)分光光度法研究了鞣花酸對(duì)DPPH·、·OH和·O2-等3種自由基的清除作用，并以彈性蛋白酶為研究對(duì)象，利用熒光光譜探討了鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的抑制作用及機(jī)理，為鞣花酸在抗衰老化妝品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴產(chǎn)地云南蒙自，購(gòu)自無(wú)錫市家樂(lè)福超市；二苯代苦味?；杂苫悍治黾?，SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品；剛果紅-彈性蛋白：SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品；豬胰彈性蛋白酶：上海邁坤化工有限公司產(chǎn)品；磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、鄰苯三酚、維生素C、硼酸、十水合四硼酸鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；TU-1901紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品；Cary Eclipse熒光光度計(jì)：澳大利亞瓦里安有限公司產(chǎn)品；SHZ-82水浴恒溫振蕩器：金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石榴皮中鞣花酸的提取參考本課題組的前期報(bào)道［8］，鞣花酸按照以下方法進(jìn)行提取。將市售的新鮮石榴，手工剝皮去籽，用清水洗凈，將石榴皮置于40℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，烘干后用粉碎機(jī)將其粉碎，所得石榴皮粉末置于干燥皿中備用。準(zhǔn)確稱取石榴皮粉末10 g置于燒杯中，按料液質(zhì)量體積比1 g∶15 mL加入pH 3.0的體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，超聲提取3次，每次40 min，減壓過(guò)濾，合并所有濾液，濃縮，真空干燥得石榴皮粗提物。將制得的粗提物懸浮于水中，用50 mL石油醚萃取5次除去脂溶性物質(zhì)后，下層水相再以50 mL乙酸乙酯萃取5次，合并上層萃取液并減壓濃縮、真空干燥，得乙酸乙酯萃取物。稱取0.2 g乙酸乙酯萃取物置于圓底燒瓶中，加入1.0 mol/L H2SO4溶液50 mL，充分混勻，于100℃磁力加熱攪拌器中水解6 h，將所得反應(yīng)液過(guò)濾，濾餅經(jīng)超純水水洗至濾液為中性，真空干燥得水解后的水不溶物即鞣花酸，保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 鞣花酸對(duì)DPPH自由基的清除作用用甲醇分別配制濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL的石榴皮粗提物溶液及鞣花酸溶液。以甲醇配制濃度為0.04 mg/mL DPPH溶液。移取1 mL樣品溶液及3 mL DPPH溶液于具塞試管中，充分混勻后，室溫下避光靜置30 min后于517 nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。以1 mL甲醇代替樣品溶液作空白測(cè)定吸光度A0，以3 mL甲醇代替DPPH溶液測(cè)定樣品溶液的吸光度A2，以維生素C為對(duì)照品。按照下式計(jì)算DPPH自由基的清除率：

1.2.3 鞣花酸對(duì)羥基自由基的清除作用用甲醇配制濃度為0.05～0.5 mg/mL的石榴皮粗提物及鞣花酸溶液。按照表1，于試管中依次加入磷酸緩沖液（PBS）、鄰二氮菲、FeSO4、樣品溶液、蒸餾水和H2O2。將上述試管同時(shí)置于恒溫水浴槽中并在37℃下保溫60 min，于510 nm處測(cè)定各組吸光度值，平行測(cè)定3次，取平均值。以維生素C為對(duì)照品，按照下式計(jì)算羥基自由基的清除率：

表1 反應(yīng)液組成與體積Table1 Compositions and volumes of reaction solution

1.2.4 鞣花酸對(duì)超氧自由基的清除作用分別移取50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）4.5 mL、4.2 mL蒸餾水于10 mL刻度管中，混勻后置于25℃水浴中預(yù)熱20 min，取出后立即加入25℃下預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，充分混勻，快速倒入比色皿中，319 nm處每隔0.5 min測(cè)一次吸光度，共反應(yīng)5 min。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，所得直線的斜率為ν0。加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的0.5 mg/mL石榴皮粗提物或鞣花酸甲醇溶液，同時(shí)蒸餾水的用量相應(yīng)減少，在319 nm處進(jìn)行時(shí)間掃描，作圖計(jì)算所得直線的斜率為ν1。以維生素C為對(duì)照品，超氧自由基的清除率計(jì)算公式如下：

1.2.5 鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶抑制率的測(cè)定采用分光光度法測(cè)定鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的抑制率。以剛果紅-彈性蛋白為底物，彈性蛋白被酶分解后，剛果紅會(huì)脫落，測(cè)定溶液中剛果紅的含量以表征酶活性。以pH 8.8硼酸鹽緩沖溶液分別配制不同濃度的鞣花酸、石榴皮粗提物、安石榴苷溶液。根據(jù)文獻(xiàn)所述方法［9］，按照表2，于具塞三角燒瓶中依次加入剛果紅-彈性蛋白及硼酸緩沖溶液，置于37℃水浴中預(yù)熱10 min，然后加入不同濃度的樣品溶液及0.2 mg/mL彈性蛋白酶溶液。將上述反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴振蕩器中振搖20 min，立即加入5.0 mL pH 6.0磷酸緩沖溶液混合終止反應(yīng)，于5 000 r/ min下離心15 min。準(zhǔn)確吸取上清液2.0 mL，加入pH 8.8硼酸緩沖液和pH 6.0磷酸緩沖液等量混合液2.0 mL，充分搖勻并于495 nm測(cè)定其吸光度，抑制率計(jì)算公式如下：

表2 反應(yīng)液組成與體積Table 2 Compositions and volumes of reaction solution

1.2.6 鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶作用機(jī)理溶液配制：配制0.05 mol/L pH 8.8 Tris-HCl緩沖液，用此緩沖液配制1.0×10-5mol/L彈性蛋白酶，并且保存于4℃冰箱中備用。用Tris-HCl緩沖液配制濃度為5.0×10-4mol/L鞣花酸，臨用時(shí)稀釋成不同濃度的樣品溶液。

熒光光譜法：分別向具塞三角燒瓶中依次加入2 mL彈性蛋白酶溶液，2 mL不同濃度的鞣花酸，在恒溫水浴中振蕩20 min，并且以Tris-HCl緩沖溶液為參比，設(shè)定熒光激發(fā)狹縫為2.5 nm，發(fā)射狹縫為10.0 nm，固定激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm，在288～500 nm自動(dòng)掃描記錄熒光發(fā)射光譜；固定激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)之差分別為15 nm和60 nm，在200～400 nm自動(dòng)掃描記錄同步熒光光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 鞣花酸對(duì)DPPH自由基的清除作用

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH，1，1diphenyl-2-picrylhydmzyl）是一種很穩(wěn)定的自由基，這是由于苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用和空間障礙作用使處在中央的氮原子上孤對(duì)的電子不能成對(duì)。DPPH在醇溶液中呈深紫色，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH中氮上的孤對(duì)電子被配對(duì)而使得溶液顏色變淺，在最大吸收波長(zhǎng)517 nm處的吸光度變小，因此吸光度值越小表明清除劑的抗氧化能力越強(qiáng)［10］。鞣花酸對(duì)DPPH自由基的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 DPPH自由基的清除作用Fig.1Elimination effect of DPPH radical

由圖1可知，石榴皮粗提物、鞣花酸及維生素C對(duì)DPPH自由基均有清除作用，清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增大。半數(shù)清除率（EC50）指清除率為50%時(shí)所需樣品的濃度，根據(jù)計(jì)算所得的EC50值可以判斷樣品的抗氧化能力強(qiáng)弱。石榴皮粗提物、鞣花酸和維生素C的EC50值分別為24.15、4.92和13.49 μg/mL，可見(jiàn)鞣花酸的清除能力最強(qiáng)，維生素C的EC50值是鞣花酸的2.7倍。結(jié)果表明三者對(duì)DPPH自由基的清除能力順序?yàn)椋瑚坊ㄋ幔揪S生素C＞石榴皮粗提物。

2.2 鞣花酸對(duì)羥基自由基的清除作用

羥基自由基是一種重要的活性氧，也是毒性最大的自由基，且反應(yīng)性強(qiáng)、壽命極短，對(duì)人體造成極大的危害。采用H2O2/Fe體系，通過(guò)Fenton反應(yīng)生成·OH后，鄰二氮菲-Fe2+被·OH氧化為鄰二氮菲-Fe3+，其在510 nm處最大吸收峰消失，根據(jù)吸光度的變化反映樣品對(duì)·OH的清除作用［11］。鞣花酸對(duì)·OH的清除結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 羥基自由基的清除作用Fig.2Elimination effect of hydroxyl radical

從圖中可以看出，石榴皮粗提物、鞣花酸及維生素C對(duì)·OH均有良好的清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，對(duì)·OH清除作用也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)鞣花酸質(zhì)量濃度為0.14 mg/mL時(shí)，清除率高達(dá)92.26%，而在此濃度范圍內(nèi)，維生素C對(duì)·OH沒(méi)有清除作用。石榴皮粗提物、鞣花酸和維生素C的EC50值分別為0.31、0.09和2.05 mg/mL，可見(jiàn)石榴皮粗提物、鞣花酸的清除率明顯高于維生素C，三者對(duì)·OH清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋瑚坊ㄋ幔臼衿ご痔嵛铮揪S生素C。

2.3 鞣花酸對(duì)超氧自由基的清除作用

圖3 超氧自由基的清除作用Fig.3Elimination effect of super oxygen radical

從上述3種自由基體系的測(cè)定結(jié)果可以看出鞣花酸具有強(qiáng)自由基清除能力，其作用機(jī)理推測(cè)如下：鞣花酸屬于酚酸類化合物，具有鄰苯二酚型酚羥基，而酚羥基是氫或質(zhì)子的給予體，酚羥基發(fā)生脫氫反應(yīng)后會(huì)與另一個(gè)酚羥基形成氫鍵，新生成的鄰苯醌結(jié)構(gòu)使苯氧自由基更穩(wěn)定，這種結(jié)構(gòu)不再具有奪取氫原子所需的能量，因而活性很弱，活性強(qiáng)的自由基（如羥基自由基、超氧自由基等）被活性弱的苯氧自由基所取代，終止了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到清除自由基的作用［12-13］。

2.4 鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的抑制作用

按照1.2.5項(xiàng)下所述方法測(cè)定鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶抑制作用，并與石榴皮粗提物及粗提物純化得到的安石榴苷作比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同石榴活性物對(duì)彈性蛋白酶的抑制作用Fig.4Inhibition of actives in pomegranate on elastase

由圖4可以看出，鞣花酸、石榴皮粗提物和安石榴苷對(duì)彈性蛋白酶活性均有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加均逐漸增強(qiáng)。當(dāng)鞣花酸的質(zhì)量濃度為4.57 mg/mL時(shí)，抑制率高達(dá)88.26%。鞣花酸、石榴皮粗提物、安石榴苷對(duì)彈性蛋白酶的IC50值分別為1.44、7.33和4.27 mg/mL，說(shuō)明彈性蛋白酶抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)轺坊ㄋ幔景彩褴眨臼衿ご痔嵛铩?/p>

2.5 鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的熒光猝滅光譜

蛋白質(zhì)中因含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等殘基而具有內(nèi)源性熒光。圖5為鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的熒光猝滅光譜。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm時(shí)，彈性蛋白酶熒光發(fā)射波長(zhǎng)在348 nm處。鞣花酸在288～500 nm范圍內(nèi)均無(wú)熒光發(fā)射峰，表明鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的熒光強(qiáng)度無(wú)影響。彈性蛋白酶的熒光強(qiáng)度隨著鞣花酸濃度的增加有規(guī)律地降低，出現(xiàn)典型的熒光猝滅現(xiàn)象。

圖5 不同溫度下鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶熒光光譜的影響Fig.5Influence of EA on fluorescence spectra of elastase at different temperatures

2.6 鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是指熒光分子的激發(fā)態(tài)分子與猝滅劑分子之間相互作用，其作用過(guò)程可以用Stern-Volmer方程表示。

式中，F(xiàn)0為無(wú)鞣花酸存在時(shí)彈性蛋白酶的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為有鞣花酸存在時(shí)彈性蛋白酶的熒光強(qiáng)度，［CQ］為鞣花酸的濃度，KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，τ0為無(wú)鞣花酸時(shí)彈性蛋白酶的平均壽命。

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作出彈性蛋白酶的Stern-Volmer曲線，從圖6中可以看出，當(dāng)鞣花酸濃度低于4.0×10-5mol/L時(shí)曲線線性良好，而濃度較大時(shí)曲線向上彎曲，相關(guān)系數(shù)下降。當(dāng)鞣花酸的濃度低于4.0×10-5mol/L時(shí)，對(duì)鞣花酸的Stern-Volmer曲線進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：y=1.072 1x+0.733 0（r=0.999 3）。根據(jù)公式5計(jì)算得到鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的熒光猝滅的速率常數(shù)kq為1.07×1013L/（mol·s），由于鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶的熒光猝滅速率常數(shù)大于生物分子在水溶液中的最大擴(kuò)散系數(shù)（2×1010L/（mol·s））3個(gè)數(shù)量級(jí)，表明在低濃度時(shí)鞣花酸對(duì)彈性蛋白酶熒光猝滅機(jī)理主要為靜態(tài)猝滅，鞣花酸與彈性蛋白酶之間形成了復(fù)合物。當(dāng)鞣花酸的濃度增大時(shí)，動(dòng)態(tài)猝滅所占比例逐漸增加，Stern-Volmer曲線偏向Y軸，此時(shí)的猝滅機(jī)理為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅同時(shí)存在的混合猝滅。

圖6 鞣花酸與彈性蛋白酶作用的Stern-Volmer曲線Fig.6Stern-Volmer curve of the interaction between EA and elastase

3 結(jié)語(yǔ)

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Studies on the Anti-Aging Effect of Ellagic Acid from Pomegranate and Its Mechanism of Action

XING Xiaoping1，YANG Xiaoxiao1，2，LU Jie2，CAO Yuhua2
（1.School of Chemical and Biotechnology，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224051，China；2.School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The anti-aging effects and mechanisms of ellagic acid from pomegranate have been studied.Firstly，free radical scavenging activity of ellagic acid was determined according to the elimination of DPPH·OH and·O2-radicals by spectrophotometry as well as the elastase inhibition activity.Secondly，the mechanism of interaction between ellagic acid and elastase was investigated with fluorescence spectra.An 88.26%inhibition rate could be reached when the ellagic acid-elastase complex was formed if the concentration of ellagic acid was 4.57 mg mL-1.The fluorescence quenching of elastase when interacted with ellagic acid was regarded as a static quenching when the concentration of ellagic acid was lower than 4.0×10-5mol L-1.The dynamic quenching increased when raised the ellagic acid concentration.Ellagic acid，a natural free radical scavenger and inhibitor，has great potential in the cosmetics industry as an anti-aging ingredient.

ellagic acid，anti-aging，spectroscopy

S665.4

A

1673—1689（2015）04—0436—07

2014-05-21

邢曉平（1975—），女，江蘇濱海人，理學(xué)博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：xingxiaoping@ycit.cn