突變敏感性分子開關(guān)檢測肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性研究

劉 艷，劉 丹，朱翠明，黃澤智，蒙松年，唐翠蓮

2.湖南省邵陽市疾病預(yù)防控制中心，邵陽 422000；

3.南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，衡陽 421001

肺炎支原體（Mycoplasmapneumoniae，Mp）是社區(qū)獲得性肺炎（CAP）最主要的病原體[1]，主要通過呼吸道傳播，在兒童和青少年中，10%～30%的CAP是由Mp感染所致，流行期間可高達(dá)40%～50%[2－3]。此外，Mp感染還可引起鼻炎、咽炎、支氣管炎、氣管炎等呼吸系統(tǒng)常見疾病，并與小兒哮喘的發(fā)病密切相關(guān)[1－3]。目前兒科治療 Mp感染一般首選大環(huán)內(nèi)酯類藥物，如紅霉素、羅紅霉素、泰利霉素（14元環(huán)）、阿奇霉素（15元環(huán)）、交沙霉素（16元環(huán)）等。近年來，Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥日趨嚴(yán)重，多國均已分離出耐大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的Mp株，其中德國約2.0%的 Mp分離株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥[4－5]，法國分離的耐藥株約為3.6%[4，6]，美國約 為 7.0%[4，7－8]，日 本 約 為 10.9%[3－4，9－11]，而我國70%以上的Mp分離株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥[4，12－17]。臨床上為避免抗生素濫用，在使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療Mp感染時常需借助于藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果來合理使用抗生素。藥敏試驗(yàn)首先必須從臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)出Mp，由于Mp的培養(yǎng)特點(diǎn)是營養(yǎng)要求高、生長緩慢（初次培養(yǎng)需10～30d），加之培養(yǎng)陽性率低，且陽性株行藥敏試驗(yàn)還需5～7d，所以，Mp的常規(guī)藥敏試驗(yàn)僅適合于回顧性診斷及研究。因此，尋找一種快速檢測 Mp藥物敏感性的方法對指導(dǎo)臨床合理用藥治療Mp感染具有重要的意義。

目前，對Mp的耐藥機(jī)制研究僅發(fā)現(xiàn)了作用靶位基因突變，即由于23SrRNA（Mp的基因組相對較小，僅有一個rRNA操縱子）與抗生素直接結(jié)合的堿基點(diǎn)突變導(dǎo)致抗生素與核糖體親和力下降而引起耐藥[4－18]。目前Mp臨床分離耐藥株中尙未檢測到23SrRNAⅡ區(qū)及核糖體蛋白L4、L22突變（體外用抗生素誘導(dǎo)時偶有突變），耐藥Mp株的突變出現(xiàn)在23SrRNAⅤ區(qū)，表現(xiàn)為2063，2064和2617位的堿基點(diǎn)突變[4－17]，因此通過檢測 Mp 23SrRNAⅤ區(qū)基因是否發(fā)生突變，可了解Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感性。

目前，檢測Mp 23SrRNA基因突變的方法很多，如基因測序[19－20]、限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[21]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）[13]、高分辨率溶解曲線分析（high resolution melting，HRM）[5－6，23]等，但這些檢測方法或靈敏度差，或耗時費(fèi)力，或需昂貴的設(shè)備，無法在基層普及應(yīng)用。因此，課題組擬尋找一種快速、簡便、高敏感、高準(zhǔn)確性的突變檢測技術(shù)來檢測23SrRNA基因的變異。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 40株Mp臨床分離株，均來自臨床急性呼吸道感染患兒的呼吸道咽拭子標(biāo)本，為前期分離培養(yǎng)鑒定的臨床菌種，冷凍保存；Mp標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 15531，由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所饋贈。

1.2 方法

1.2.1 微量稀釋法測定MIC值 將凍存的Mp臨床分離株置于室溫溶解，用微量稀釋法測定其對5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、交沙霉素，均為中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品）的MIC值。

1.2.2 建立高保真聚合酶和3′硫化修飾引物的分子開關(guān)，并用分子開關(guān)檢測23SrRNA V區(qū)2063／2064、2617基因是否發(fā)生突變。

1.2.2.1 Mp基因組DNA的抽提 將冷凍保存的Mp臨床分離株取出進(jìn)行傳代復(fù)蘇，待生長時間比較穩(wěn)定（約7d）后，吸取20μL菌液加入到1.5mL的離心管中，離心（13 000×g）10min，棄上清液，再加標(biāo)本處理液200μL，混勻，100。C的沸水中水浴10min，此液作為DNA模板備用。

1.2.2.2 硫化修飾引物的設(shè)計(jì) 上游野生型引物設(shè)計(jì)：A2063G／C和A2064G的突變均可導(dǎo)致紅霉素高水平耐藥，而C2617G／A的突變可引起紅霉素、阿奇霉素、泰利霉素的低水平耐藥，因此，依據(jù)耐藥堿基是否突變來判斷Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感性時，僅需區(qū)分2063／2064位或2067位突變，不需區(qū)分2063與2064位突變，也勿需了解突變類型即可了解Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感性。由于硫化修飾引物3′末端上游不配對堿基均不能被exo＋高保真酶延伸，故只需設(shè)計(jì)2對針對Mp敏感株的3′末端硫化修飾引物（野生型引物）即可，一對用于檢測2063／2064位堿基突變，另一對用于檢測2617位點(diǎn)突變。

下游引物設(shè)計(jì)：為避免單引物PCR擴(kuò)增，不在反向重復(fù)序列區(qū)域設(shè)計(jì)下游引物，同時控制擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)、提高退火溫度，使單引物僅能擴(kuò)增出大小不等、低豐度的單鏈DNA產(chǎn)物甚至不擴(kuò)增。因?yàn)榄傊悄z電泳分辨率較低，所以檢測結(jié)果表現(xiàn)為“關(guān)”的效應(yīng)。硫化修飾引物序列詳見表1。

表1 23SrRNA V區(qū)2063／2064、2617基因硫化修飾引物Tab.1 Phosphorothioate modification of the 2063／2064and 2617in domain V of M.pneumoniae 23SrRNA genes

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增目的基因片段 反應(yīng)體系為：雙蒸水8.5μL，2×PCR Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL。反應(yīng)條件為：94。C預(yù)變性10min→94。C變性1min→65。C退火45s→72。C延伸45s的PCR循環(huán)，共30個循環(huán)，最后72。C延伸10min，4。C終止反應(yīng)。

1.2.2.4 PCR產(chǎn)物的電泳及結(jié)果判斷 對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其是否有目的片段來判斷23SrRNA V區(qū)2063／2064、2617基因是否發(fā)生突變。

1.2.3 普 通 PCR 擴(kuò) 增 23SrRNA V 區(qū) 2063／2064、2617基因，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行基因測序，用BLAST軟件分析序列，檢查是否發(fā)生基因突變。

1.2.3.1 Mp基因組 DNA的抽提 同1.2.2.1

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增目的基因片段及DNA測序參考Lucier等[23]報道的擴(kuò)增23SrRNAⅤ區(qū)的引物序列，由上海生工合成，引物序列見表2。反應(yīng)體系為：雙蒸水8.5μL，2×PCR Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL。反應(yīng)條件為：94。C預(yù)變性10min→94。C變性1min→65。C退火45s→72。C延伸45s的PCR循環(huán)，共30個循環(huán)，最后72。C延伸10min，4。C終止反應(yīng)。對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其是否有目的片段，并對陽性產(chǎn)物進(jìn)行純化，送上海生工測序。最后利用BLAST軟件將測序結(jié)果與GenBank上所收錄的編碼序列進(jìn)行比較分析，檢查是否發(fā)生堿基突變。

表2 普通PCR擴(kuò)增23SrRNAⅤ區(qū)2063／2064、2617基因的引物Tab.2 Primers of the 2063／2064and 2617in domain V of M.pneumoniae 23SrRNA genes for ordinary PCR amplification

2 結(jié) 果

2.1 40株Mp臨床株中，38株對紅霉素耐藥（MIC≥128mg／L），耐藥率為95.00%（38／40）。5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中，Mp對15元環(huán)的阿奇霉素、交沙霉素相對敏感，其中對交沙霉素的敏感性最高，其MIC≤4mg／L。

2.2 分子開關(guān)檢測Mp 23SrRNA基因突變 分別在不同的反應(yīng)體系中應(yīng)用分子開關(guān)快速檢測 Mp 23SrRNA基因的2063、2064和2617位的堿基是否發(fā)生突變。在不同的反應(yīng)體系中，應(yīng)用分子開關(guān)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。當(dāng)引物與模板完全配對時（即無堿基突變時），分子開關(guān)表現(xiàn)為“開”，引物被延伸，生成特異性PCR產(chǎn)物；當(dāng)引物與模板不完全配對時（即有堿基突變時），分子開關(guān)處于“關(guān)”，引物不能被延伸，無特異性PCR產(chǎn)物生成。

40株Mp臨床株分別用2063／2064、2617位野生型（未突變）的硫化修飾引物，使用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中有2株Mp臨床株擴(kuò)增出大小約200bp的產(chǎn)物，38株Mp臨床株未擴(kuò)增出200bp的產(chǎn)物（圖1）；40株 Mp臨床株均擴(kuò)增出大小約220bp的產(chǎn)物（圖2）。即38株 Mp臨床株的23S rRNA的2063或2064位發(fā)生了基因突變，40株Mp臨床株的2617位均未發(fā)生基因突變。

圖1 分子開關(guān)檢測2063／2064基因突變結(jié)果Fig.1 Results of the on／off switches detecting the 23SrRNA gene mutations at position 2 063／2 064

圖2 分子開關(guān)檢測2617基因突變結(jié)果Fig.2 Results of the on／off switches detecting the 23SrRNA gene mutations at position 2 617

2.3 DNA測序分析Mp 23SrRNA基因突變

2.3.1 普通PCR擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的基因序列用普通PCR分別擴(kuò)增含 Mp 23SrRNA 2063／2064、2617位點(diǎn)的基因片段，自40例臨床標(biāo)本中均擴(kuò)增出210bp、496bp的基因片段，見圖3、圖4。

2.3.2 PCR產(chǎn)物DNA分析 擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工測序，并將測序后的序列與M129（敏感標(biāo)準(zhǔn)株）進(jìn)行BLAST序列比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：40株Mp中有35株檢測出A2063G的突變，3株檢測出A2064G的突變，未發(fā)現(xiàn)2617位點(diǎn)突變。

圖3 PCR擴(kuò)增包含Mp 23SrRNA 2063／2064位點(diǎn)的基因片段Fig.3 PCR amplification of M.pneumoniae 23SrRNA gene mutations（containing position 2 063／2 064）

圖4 PCR擴(kuò)增包含Mp 23SrRNA 2617位點(diǎn)的基因片段Fig.4 PCR amplification of 23SrRNA gene mutations（containing position 2 617）

2.4 分子開關(guān)、基因測序檢測耐藥基因與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感性分析 用分子開關(guān)和基因測序2種不同方法均從40株Mp臨床株中檢測到38株發(fā)生了23SrRNA 2063／2064基因位點(diǎn)突變，這38株Mp臨床株對紅霉素呈高水平耐藥，并對阿奇霉素、交沙霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性（見表3）。38株2063／2064基因位點(diǎn)突變的 Mp臨床株對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的MIC值：紅霉素和克拉霉素為32～ ≥128mg／L，阿奇霉素為16～64mg／L，交沙霉素為0.0125～8mg／L。未發(fā)生突變的2株Mp臨床株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均敏感，其對紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素和交沙霉素的MIC均為 ≤0.004mg／L。通過分子開關(guān)檢測23SrRNAⅤ區(qū)基因是否有突變，可初步了解Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感性。

3 討 論

Mp是兒童和青少年發(fā)生急性呼吸道感染的重要病原體之一，在自然界中廣泛存在，主要是通過空氣、飛沫傳播。由Mp引發(fā)的肺炎及各種肺外并發(fā)癥，對兒童健康的危害非常大。對于兒童患者而言，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是治療Mp感染的首選藥物，其中以紅霉素及其衍生物最為常用，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，耐大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的Mp臨床株日趨增多[22]。

表3 分子開關(guān)、基因測序檢測耐藥基因及其與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感性的相關(guān)性分析Tab.3 On／off switches，resistant gene detection by DNA sequencing and the correlation assays of the susceptibility of M.pneumoniaeto macrolide antibiotics

Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制尙未發(fā)現(xiàn)滅活酶及藥物主動外排系統(tǒng)，僅發(fā)現(xiàn)23SrRNA V區(qū)基因 A2063G／C，A2064G，C2617G／A的點(diǎn)突變導(dǎo)致抗生素與核糖體親和力下降而引起耐藥[4－18]。因此，通過檢測23SrRNA基因可反應(yīng)Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感性。

2003年李凱教授發(fā)明的一種新的突變檢測技術(shù)——基于高保真DNA聚合酶的分子開關(guān)，此分子開關(guān)由高保真DNA聚合酶與硫化修飾堿基特異性引物構(gòu)成，可與電泳等多種現(xiàn)有的技術(shù)聯(lián)合使用，檢測單一或多個已知單堿基多態(tài)性位點(diǎn)。高保真DNA聚合酶既有5′→3′DNA聚合酶活性，亦具3′→5′外切酶活性，能從3′→5′方向識別不匹配的DNA鏈末端的核苷酸并進(jìn)行校正。研究發(fā)現(xiàn)，對硫化修飾的堿基特異性引物而言，高保真DNA聚合酶分子中的聚合中心和3′→5′外切酶酶解中心既合作又獨(dú)立地起到了復(fù)合分子開關(guān)中“開”和“關(guān)”的作用。即：當(dāng)硫化修飾引物與模板完全匹配時，分子開關(guān)表現(xiàn)為“開”的狀態(tài)，引物被延伸，有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物生成；當(dāng)引物與模板不完全匹配時，分子開關(guān)將處于“關(guān)”的狀態(tài)，引物則不能被延伸，無特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生。用分子開關(guān)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聯(lián)合瓊脂糖電泳分析結(jié)果時，可以根據(jù)有無特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物來判斷是否存在堿基突變。與現(xiàn)有的突變檢測方法相比，由高保真DNA聚合酶與硫化修飾堿基特異性引物所構(gòu)成分子開關(guān)具有以下6個特點(diǎn)：①快速：整個實(shí)驗(yàn)耗時通常小于4h；②簡單：通過瓊脂糖凝膠上的條帶或直接觀察熒光信號即可分析；③準(zhǔn)確：該分子開關(guān)表現(xiàn)出引物與模板匹配則引物被延伸、不匹配則引物不延伸的“開”、“關(guān)”效應(yīng)，準(zhǔn)確度高；④檢測成本低：不需要昂貴的儀器設(shè)備；⑤經(jīng)多重PCR擴(kuò)增，對不同的突變位點(diǎn)或突變類型可在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行分析；⑥可大范圍推廣：該分子開關(guān)與PCR、RT－qPCR相結(jié)合，能大范圍在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中推廣使用。目前，此分子開關(guān)已成功用于多種基因突變的檢測，如檢測線粒體16SrRNA A1555G和 C1494T 的突變[24]。

本研究構(gòu)建了高保真DNA聚合酶和3′硫化修飾引物的分子開關(guān)，分別在不同反應(yīng)體系中快速檢測 Mp 23SrRNA基因的2063／2064和2617位的堿基是否發(fā)生突變，檢測結(jié)果與DNA測序結(jié)果一致，40株 Mp中有38株發(fā)生了23SrRNA 2063／2064基因位點(diǎn)突變，且這38株Mp對紅霉素呈高水平耐藥，對阿奇霉素、交沙霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性。Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的MIC值：紅霉素、克拉霉素為32～≥128mg／L，阿奇霉素為16～64mg／L，交沙霉素為0.012 5～8mg／L。2株Mp臨床株未檢測出突變，對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均敏感，紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素和交沙霉素的 MIC均 為≤0.004mg／L。因此，通過分子開關(guān)檢測23SrRNAⅤ區(qū)基因是否發(fā)生突變，可初步了解Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感性。

本研究是應(yīng)用分子開關(guān)在不同反應(yīng)體系中檢測Mp 23SrRNA基因2063／2064及2617位的堿基是否發(fā)生突變，以后我們將在同一反應(yīng)體系中，依據(jù)特異性擴(kuò)增片段的有無和片段的大小來檢測2063、2064和2617 3個位點(diǎn)突變，或用分子開關(guān)進(jìn)行熒光定量PCR，在同一反應(yīng)體系或不同反應(yīng)體系中依據(jù)熒光信號的有無確定是否有突變，根據(jù)熒光信號的顏色確定是否有突變及突變位點(diǎn)。

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