貴州省一例人感染豬鏈球菌病例的病原學(xué)檢測(cè)與分析

馬 青，李世軍，劉 英，田克誠(chéng)，唐光鵬，王定明

人感染豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（Streptococcussuis）感染人而引起的人獸共患病[1]，豬鏈球菌（S.suis）目前已知有35個(gè)血清型，其中豬鏈球菌2型（S.suisserotype 2）在世界上流行最廣，致病性最強(qiáng)，同時(shí)能引起人的感染，是一種重要的人獸共患病病原[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)已發(fā)生多起人感染豬鏈球菌病疫情，1998年我國(guó)江蘇省豬鏈球菌病暴發(fā)，造成數(shù)萬(wàn)頭生豬死亡，并導(dǎo)致幾十例人感染豬鏈球菌病，死亡14例[3]；2005年四川省報(bào)告人感染豬鏈球菌病204例，死亡38例，為國(guó)內(nèi)外迄今為止見(jiàn)于報(bào)道的最大規(guī)模人感染豬鏈球菌病疫情[4]；人感染豬鏈球菌病散發(fā)病例在其它省份也時(shí)有發(fā)生[1，5－7]。貴州省2006年于羅甸縣一例病例中分離出豬鏈球菌2型菌株[8]。本研究對(duì)2013年貴州省1起人感染豬鏈球菌疑似疫情進(jìn)行病原學(xué)調(diào)查與分析，了解病原學(xué)特征，為疫情的確定及患者的診斷和治療提供病原學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例信息 患者邰某某，男，42歲，來(lái)自劍河縣觀么鄉(xiāng)觀么村，該村位于劍河縣觀么鄉(xiāng)政府所在地，距離劍河縣人民政府所在地65km。觀么村有4個(gè)村民小組，186戶，928人，均為苗族。家畜為圈養(yǎng)，無(wú)放養(yǎng)習(xí)慣?；颊咴?013年2月4日宰殺自家年豬，當(dāng)日又到本村村民費(fèi)某某家宰殺生豬1頭，2月5日又到該村另一村民錢某某家宰殺生豬，在分割肉時(shí)不小心劃傷左手指，于2013年2月15日發(fā)病，臨床癥狀主要有寒戰(zhàn)、發(fā)熱和嗜睡狀，病程進(jìn)展迅速，腦膜炎癥狀明顯，經(jīng)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床診斷為人感染豬鏈球菌病疑似病例。

1.2 標(biāo)本 經(jīng)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床診斷的1例劍河縣人感染豬鏈球菌病疑似病例的血液來(lái)源菌株。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 豬鏈球菌2型單克隆抗體由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供，API 20Strep生化鑒定條購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，PCR試劑為Takara公司生產(chǎn)商品試劑盒。

1.4 菌落觀查與染色鏡檢 將可疑菌株接種于血瓊脂平板置37。C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察菌落特征，挑取單個(gè)可疑菌落進(jìn)行革蘭染色后鏡檢。

1.5 血清分型試驗(yàn) 挑取菌落做玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照。

1.6 生化鑒定 挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種羊血瓊脂平板，于37。C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。按照API 20 Strep試劑盒說(shuō)明書操作根據(jù)生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行編碼，對(duì)照API 20Strep生化系統(tǒng)編碼判定結(jié)果[9]。

1.7 豬鏈球菌靶基因檢測(cè) 按照中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供的引物，見(jiàn)表1和PCR方法檢測(cè)豬鏈球菌種特異的16SrRNA基因、豬鏈球菌2型cps2J、mrp、sly和ef。反應(yīng)體系（50μL）為上下游引物各2 μL、模板2μL、Taqmix 25μL、去離子水19μL。mrp、cps2J和16SrRNA基因的擴(kuò)增參數(shù)為94。C預(yù)變性5min；94。C30s，56。C30s，72。C30s，30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5min。Sly基因擴(kuò)增參數(shù)為94。C預(yù)變性5min；94。C60s，51。C60s，72。C90s，30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5min。Ef基因擴(kuò)增參數(shù)為94。C預(yù)變性5min；94。C30s，56。C30s，72。C30s，30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5min。

表1 豬鏈球菌基因檢測(cè)引物Tab.1 Primers of Streptococcus suis

2 結(jié) 果

2.1 菌落特征與鏡檢結(jié)果 可疑菌株在羊血瓊脂平板上于37。C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后出現(xiàn)直經(jīng)約1mm、表面突起、光滑濕潤(rùn)、圓整、半透明略帶灰白色、呈α溶血的菌落，革蘭染色后油鏡下呈成對(duì)或短鏈狀革蘭氏陽(yáng)性球菌。

2.2 血清分型結(jié)果 可疑菌株菌落與豬鏈球菌2型單克隆抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，生理鹽水對(duì)照未發(fā)生凝集反應(yīng)。

2.3 生化鑒定結(jié)果 血液中分離菌株的API 20 Strep生化試驗(yàn)結(jié)果編碼為4640453，對(duì)照編碼表結(jié)果判定為豬鏈球菌II型，API 20Strep生化結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.4 PCR檢測(cè)結(jié)果 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示豬鏈球菌種特異的16SrRNA基因、豬鏈球菌2型特有的毒力基因cps2J及毒力基因mrp、sly和ef均出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA擴(kuò)增條帶，見(jiàn)圖1。

3 討 論

豬鏈球菌是一種人獸共患病原菌，呈世界性分布。豬鏈球菌共有35個(gè)血清型，盡管所有血清型都能致病，但是能感染人的致病血清型主要包括1／2、1、2、7、9和14型6種類型。其中血清2型廣泛存在于豬的呼吸道中，是從病豬和患者中分離最多的一種致病菌，也是我國(guó)的主要致病菌，引起1998年江蘇和2005年四川人感染豬鏈球菌病疫情大暴發(fā)的病原也是血清2型菌株[4－5]。豬鏈球菌2型具有很強(qiáng)的侵襲能力，并產(chǎn)生致病性很強(qiáng)的外毒素，引起感染者發(fā)生嚴(yán)重的不可逆的休克及DIC，最后發(fā)生多器官功能衰竭而死亡[2]。

表2 疑似豬鏈球菌菌株生化鑒定結(jié)果Tab.2 Biochemical identification results of suspected Streptococcus suis

圖1 疑似豬鏈球菌菌株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoretic bands of suspected Streptococcus suis

API 20Strep生化條與常規(guī)生化試驗(yàn)相比，操作方便且可直接鑒定到型，馮澤惠[9]等應(yīng)用此方法對(duì)24株鏈球菌進(jìn)行了種的鑒定，鑒定符合率達(dá)91.67%。因此API 20Strep生化條可作為豬鏈球菌的一種簡(jiǎn)便可靠的方法。本研究應(yīng)用API 20 Strep生化系統(tǒng)對(duì)疑似菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果為豬鏈球菌2型，并與血清凝集試驗(yàn)結(jié)果相符。

豬鏈球菌16SrRNA基因片段具有種特異性，cps2J基因?yàn)樨i鏈球菌2型的特異性基因，可以作為鑒定豬鏈球菌2型的靶基因，因此本研究選擇16SrRNA和cps2J基因?qū)σ伤凭赀M(jìn)行鑒定，其結(jié)果均為陽(yáng)性，提示本研究中的疑似菌株為豬鏈球菌2型菌株。據(jù)資料報(bào)道[10]，并不是所有豬鏈球菌2型都對(duì)人致病，豬鏈球菌2型存在著強(qiáng)致病力、弱致病力以及無(wú)致病力菌株。豬鏈球菌2型致病力取決于它的毒力因子，其中較為重要的主要包括莢膜多糖（cps）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、細(xì)胞外因子（ef）、溶血素（sly）以及多種具有毒性作用的蛋白。曾巧英等[11]研究證明mrp可單獨(dú)作為豬鏈球菌2型的毒力因子。由于mrp和ef在強(qiáng)毒株中檢出率很高，在非致病菌株中檢出率很低，因而mrp和ef常被認(rèn)為是豬鏈球菌2型高致病性的標(biāo)志[12]。為了證實(shí)本研究中的菌株為有致病力的菌株，本研究以cps2J、mrp、sly和ef為靶基因?qū)σ伤凭赀M(jìn)行了PCR鑒定，其結(jié)果均為陽(yáng)性，表明本次分離菌株為豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株。

流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，本研究中患者曾于2013年2月4日宰殺自家年豬，當(dāng)日又到本村村民費(fèi)某某家宰殺生豬1頭，2月5日又到該村另一村民錢某某家宰殺生豬，在分割肉時(shí)不小心劃傷左手指，于2月15日晚出現(xiàn)頭痛、嘔吐、畏寒發(fā)熱等癥狀。結(jié)合本研究病原學(xué)調(diào)查結(jié)果，可以判定該起疫情為一起人感染豬鏈球菌病疫情，患者感染途徑為接觸被豬鏈球菌污染的生豬肉通過(guò)傷口而感染。

值得關(guān)注的是，患者家及幫忙宰殺豬的兩戶村民家中喂養(yǎng)的生豬中均無(wú)病死現(xiàn)象，患者此次宰殺生豬之前也未曾接觸過(guò)病死豬，也未到過(guò)外地。說(shuō)明表觀健康豬群有攜帶致病性豬鏈球菌2型的可能性，應(yīng)在加強(qiáng)表觀健康豬群的豬鏈球菌監(jiān)測(cè)的同時(shí)，對(duì)從事生豬屠宰、加工、銷售等從業(yè)人員或其他相關(guān)人員采取嚴(yán)格的個(gè)人防護(hù)措施以防止豬鏈球菌感染。

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