某醫(yī)院2012－2013年242株肺炎克雷伯菌β－內(nèi)酰胺酶及整合子耐藥基因檢測

郭 普，賀曉珊，梅傳忠，李興武，劉雙成，沈繼龍

2.蚌埠醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，蚌埠 233003；

3.安徽病原生物學省級實驗室和人獸共患病安徽省重點實驗室，安徽醫(yī)科大學病原學教研室，合肥 230032

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染重要的條件致病菌，常引起肺炎、尿路感染、腦膜炎、敗血癥等[1－2]。近年來，由肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染不斷增多，尤其在ICU，已成為常見的醫(yī)院感染病原菌，特別是目前大劑量廣譜抗菌藥物的廣泛應用甚至濫用，使得該菌的多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴重，給臨床治療帶來極大的困難。為了解我院肺炎克雷伯菌的耐藥特性及耐藥基因分布情況，筆者對我院2012年1月至2013年5月分離的肺炎克雷伯菌進行了β－內(nèi)酰胺酶及整合子耐藥基因檢測并進行耐藥分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 收集2012年1月－2013年5月蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌242株（去除同一患者同一部位的重復菌株），其中來自痰標本 104株 （42.98%）、創(chuàng)面分泌物70株（28.93%）、尿液24株（9.29%）、全血和骨髓24株（9.29%）、其它標本20株（8.26%）。標本的采集、送檢、處理依據(jù)第3版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》。

1.2 儀器及試劑 VITEK 2－compact全自動細菌鑒定藥敏系統(tǒng)：法國梅里埃公司生產(chǎn)；PCR擴增儀：德國Biomera產(chǎn)品；電泳儀：美國Bio－Rad公司產(chǎn)品。細菌鑒定及藥敏試驗卡為儀器原裝配套產(chǎn)品，EX－taq聚合酶和DNA分子量標準均為大連寶生物公司產(chǎn)品。質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603，大腸埃希菌ATCC25922購自衛(wèi)生部臨檢中心。陽性對照的 TEM、SHV、OXA－10、KPC－gp、KPC－qc、DHA、intI－1、intI－2、intI－3產(chǎn)酶菌株由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院沈繼錄博士惠贈。

1.3 細菌鑒定和藥敏實驗 所有細菌的鑒定和藥敏實驗采用法國的VITEK 2－compact全自動細菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)。

1.4 PCR擴增和序列分析

1.4.1 引物設計及合成 根據(jù)GenBank公布的blaTEM、blaSHV、blaOXA－10、KPC－gp、KPC－qc、DHA、intI－1、intI－2、intI－3 的 DNA 序 列，使 用Prime Premier 5.0軟件設計引物，引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列及退火溫度、產(chǎn)物大小見表1。

表1 各基因型片段引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequences，annealing temperature and products size of the genotypes

1.4.2 PCR擴增 PCR反應體積為50μL，反應體系：EX Taq酶0.5μL、10×PCR 緩沖液 （含Mg2＋）5μL、dNTP混合物4μL、模板DNA 3μL、上下游引物各1μL（10μm／μL）、超純水補足至50 μL。反應條件：94。C預變性7min，94。C40s、63。C 40s、72。C40s、30個循環(huán)，72。C10min、4。C保溫。同時設陽性對照及陰性對照，將擴增片段進行凝膠電泳、成像。

2 結(jié) 果

2.1 感染部位 242株肺炎克雷伯菌主要來自呼吸道標本和手術(shù)切口為主，分別占42.98%和28.93%。

2.2 感染病區(qū)分布 242株肺炎克雷伯菌在ICU分離率最高，其次為急診外科，分別為30.17%和7.02%，其在不同科室的具體分布見表2。

表2 242株肺炎克雷伯菌臨床科室分布Tab.2 Distribution of 242 Klebsiella pneumonia strains isolated from clincal departments.

2.2 藥敏分析 242株肺炎克雷伯菌對16種抗生素存在不同程度的耐藥，其中氨曲南、頭孢唑啉、氨芐西林／舒巴坦、頭孢曲松和頭孢他啶耐藥率較高，耐藥率分別為76.86%、65.70%、63.64%、62.40%和59.92%，對亞胺培南、丁胺卡那、厄他培南和哌拉西林／他唑巴坦較為敏感，耐藥率分別為：17.77%、18.88%、18.88%、和23.55%。見表3。

2.3 耐藥基因檢測 β－內(nèi)酰胺酶耐藥基因中ESBLs基因陽性155株，占64.05%，主要為TEM型和SHV型，兩者同時存在的菌株有114株，占產(chǎn)ESBLs基因菌株的 73.55%（114／155）。其次為KPC基因86株，占35.54%；AmpC基因43株，占17.77%，全部為DHA型。整合子基因128株，占52.89%，以整合子1（intI－1）為主，共檢出120株，占49.59%?；蚍植家姳?。部分PCR擴增結(jié)果的電泳圖片見圖1。

表3 242株肺炎克雷伯菌對16種抗生素耐藥率Tab.3 Drug－resistant rate of 242 Klebsiella pneumonia strains against 16kinds of antibiotics

表4 242株肺炎克雷伯菌的耐藥基因分布Tab.4 Drug－resistant gene distribution of 242 Klebsiella pneumonia strains

圖1 DHA和intI1耐藥基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR analysis of DHA genotype and intI1

3 討 論

肺炎克雷伯菌是導致醫(yī)院感染常見和重要的條件致病菌，近年來，隨著新型廣譜抗菌藥物在臨床廣泛使用，各種侵入性診療活動的增加，肺炎克雷伯菌在臨床的感染率及對多種抗生素的耐藥率呈逐漸上升的趨勢，部分菌株甚至對高效、廣譜的亞胺培南等碳青霉烯類抗生素也產(chǎn)生了耐藥性，出現(xiàn)了多重耐藥甚至泛耐藥菌株，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)[3－5]。肺炎克雷伯菌可引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行。目前國內(nèi)外都有引起暴發(fā)流行的相關(guān)報道[6－8]，Snitkin.ES等報道美國國立衛(wèi)生研究院臨床中心發(fā)生了碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，國內(nèi)張曉蕓等也報道了泛耐藥肺炎克雷伯菌引起ICU醫(yī)院感染的暴發(fā)流行。因此，對肺炎克雷伯菌耐藥菌株的耐藥機制進行檢測，明確其耐藥特性，以指導臨床合理用藥，減少耐藥發(fā)生，預防醫(yī)院感染的暴發(fā)流行成為迫切需要解決的問題。

本研究結(jié)果顯示，我院肺炎克雷伯菌的感染主要分布在ICU、外科病區(qū)及呼吸病科，感染部位以呼吸道感染為主占42.98%，其次為手術(shù)切口占28.93%，與相關(guān)報道相近[1]。ICU 及呼吸病科收治的患者大多在嚴重的基礎病、自身免疫水平低下、長期大量使用多種抗生素、住院時間長，氣管切開、氣管插管、呼吸機的使用等侵入性診療操作較多，破壞了機體的防御屏障，使得呼吸道分泌功能減弱，導致肺炎克雷伯菌的感染率高于其它病區(qū)。外科手術(shù)病區(qū)也常易受該菌的感染。值得關(guān)注的是該菌曾多次短時間內(nèi)在ICU同一病區(qū)、同一病房內(nèi)發(fā)生感染，均為泛耐藥菌，鑒定號也相同，說明引起感染的細菌可能來自同一克隆，有引起醫(yī)院感染暴發(fā)流行的傾向。

從藥敏結(jié)果看，242株肺炎克雷伯菌對16種抗生素存在不同程度的耐藥，其中β－內(nèi)酰胺類抗生素氨曲南、頭孢唑啉、氨芐西林／舒巴坦、頭孢曲松和頭孢他啶耐藥率較高，耐藥率都高于60.00%，碳青霉烯類抗生素亞胺培南、厄他培南耐藥率也分別達到了17.77%、18.18%，周榮[1]等研究發(fā)現(xiàn) 2008－2011年重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院分離的855株肺炎克雷伯菌對β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率除頭孢唑林其余均低于50.00%，亞胺培南和厄他培南耐藥率僅為6.30%、4.20%。2012年中國CHINET報道[2]肺炎克雷伯菌對β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率14.1%～53.7%，亞胺培南和厄他培南耐藥率為8.90%、12.90%，均略低于我院耐藥結(jié)果。文獻報道，產(chǎn)ESBLs、KPC、AmpC等β－內(nèi)酰胺酶是肺炎克雷伯菌對β－內(nèi)酰胺類抗生素主要耐藥機制之一[9－10]。本研究發(fā)現(xiàn)242株耐藥菌株中 ESBLs基因陽性155株，占64.05%；其次為KPC基因86株，占35.54%；AmpC基因43株，占17.77%，全部為DHA基因。在ESBLs基因中主要為TEM型和SHV型，與蔡俊、雷金娥和Freitas F等報道結(jié)果相近[9－11]。本組細菌中整合子基因陽性的有128株，占52.89%，以整合子1（intI－1）為主，共檢出120株，占49.59%，略低于毛璞等報道的結(jié)果57.91%[12]。整合子屬可移動的基因元件，能位于細菌的質(zhì)粒和染色體上，在細菌耐藥及耐藥基因的水平傳播中具有重要的意義，且一個整合子可捕獲多個耐藥基因盒，表達對不同抗生素的耐藥性。我院分離的多重耐藥的肺炎克雷伯菌對β－內(nèi)酰胺類及含酶抑制劑的抗生素耐藥率高，除了和產(chǎn)生各種β－內(nèi)酰胺酶、整合子的水平傳播有關(guān)，可能還存在高表達的外排泵系統(tǒng)、外膜蛋白的丟失等其他耐藥機制，有待于進一步研究。此外，本組細菌對氨基糖苷類、氟喹諾酮類的抗生素耐藥率也高于50.00%，具體耐藥機制也有待于進一步研究。本組肺炎克雷伯菌亞胺培南、丁胺卡那、厄他培南和哌拉西林／他唑巴坦較為敏感，耐藥率均小于30.00%，可以作為經(jīng)驗性治療選藥。

綜上所述，我院肺炎克雷伯菌對多種抗生素耐藥率高，耐藥機制復雜，臨床應根據(jù)藥敏結(jié)果規(guī)范合理使用抗生素，同時加強醫(yī)院感染的監(jiān)控，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生和播散。

[1]Zhou R，Zhu WM，Huang WX，et al.Distribution and antibiotic resistance of 855isolates ofKlebsiellapneumoniae[J].Chin J Antibiotics，2013，38（5）：363－367.（in Chinese）周蓉，朱衛(wèi)民，黃文祥，等.855株肺炎克雷伯菌感染的臨床分布及耐藥性分析[J].中國抗生素雜志，2013，38（5）：363－367.

[2]Wang F，Zhu DM，Hu FP，et al.2012CHINET surveillance of bacterial resistance in China[J].Chin J Infect Chemother，2013，139（5）：321－330.（in Chinese）汪復，朱德妹，胡付品，等.2012年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志，2013，13（5）：321－330.

[3]Li YH，Pang F，Jia XQ，et al.Epidemiology analysis and resistance observation on the antibiotics of carbapenem－non－susceptibleKlebsiellapneumoniae[J].Shandong Med J，2013，53（7）：57－59.（in Chinese）李艷華，龐峰，賈秀芹，等.碳青霉烯類抗菌藥物敏感性降低的肺炎克雷伯菌流行病學分析及耐藥性觀察[J].山東醫(yī)藥，2013，53（7）：57－59.

[4]Yang JH，Lv Y.Current prevalence and epidemiologic analysis of carbapenem resistant ofKlebsiellapneumoniaein China[J].Chin J Clin Pharmacol，2012，28（5）：323－326.（in Chinese）楊金輝，呂媛.中國肺炎克雷伯菌碳青霉烯類抗生素耐藥現(xiàn)狀和流行病學分析[J].中國臨床藥理學雜志，2012，28（5）：323－326.

[5]Weng XB，Mi ZH.Emergence of four kinds of beta－lactamace genes in an isolate of MDRKlebsiellapneumoniaein china[J].Chin J Zoonoses，2014，30（3）：329－331.（in Chinese）

[6]Snitkin ES，Zelazny AM，Thomas PJ，et al.Tracking a hospital outbreak of carbapenem－resistantKlebsiellapneumoniaewith whole－genome sequencing[J].Sci Transl Med，2012，4（148）：148ra116.DOI：10.1126／scitranslmed.3004129

[7]Cuzon G，Naas T，Demachy MC，et al.Nosocomial outbreak ofKlebsiellapneumoniaeharbouring bla（KPC－3）in France subsequent to a patient transfer from Italy[J].Int J Antimicrob A－gents，2012，9（5）：448－449.DOI：10.1016／j.ijantimicag.2012.01.008

[8]Zhang XY，Tan XY，Li DH，et al.Outbreak and control of hospital infection of Pandrug－resistantKlebsiellapneumoniaein ICU[J].Chin J Nosocomiol，2012，22（1）：79－80.（in Chinese）張曉蕓，譚曉燕，李冬麗，等.ICU泛耐藥肺炎克雷伯菌肺部感染暴發(fā)與控制[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2012，22（1）：79－80.

[9]Cai J.Drug resistance and genotype of plasmid AmpC enzyme inKlebsiellapneumoniaein a hospital[J].Chongqing Med，2012，41（24）：2510－2512.（in Chinese）蔡俊.某院肺炎克雷伯菌產(chǎn)質(zhì)粒AmpC酶基因型及耐藥性研究[J].重慶醫(yī)藥，2012，41（24）：2510－2512.

[10]Lei JE，Da R，Zhang KG，et al.Genotypes of extended spectrum beta－lactamases in clinical isolates ofKlebsiellapneumoniae[J].J Xi’an Jiaotong Univ：Med Sc，2012，33（6）：702－706.（in Chinese）雷金娥，答嶸，張凱歌，等.肺炎克雷伯菌產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶的基因分型[J].西安交通大學學報：醫(yī)學版，2012，33（6）：702－706.

[11]Freitas F，Machado E，Ribeiro TG，et al.Long－term dissemination of acquired AmpCβ－lactamases amongKlebsiellaspp.andEscherichiacoliin Portuguese clinical settings[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2014，33（4）：551－558.DOI：10.1007／s10096－013－1983－9

[12]Mao P，F(xiàn)u W，Qiu GX，et al.Detection and characterization of class I integrons inKlebsiellapneumoniae[J].Chin J Antibiotics，2013，38（3）：235－238.（in Chinese）毛璞，傅威，邱桂霞，等.肺炎克雷伯菌I型整合子的檢測與鑒定[J].中國抗生素雜志，2013，38（3）：235－238.