探針熔解曲線法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌注射類(lèi)二線藥耐藥突變

張 婷，付 軍，王國(guó)治，陳保文，楊 蕾，盧錦標(biāo)，許 曄，李慶閣

2.中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室，北京100050

我國(guó)結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況嚴(yán)重，耐藥率高，給結(jié)核病的預(yù)防和治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。耐多藥結(jié)核?。∕ultidrug－resistant tuberculosis，MDR－TB）是指至少對(duì)異煙肼和利福平具有耐藥性，廣泛耐藥結(jié)核 病 （Extensively drug－resistant tuberculosis，XDR－TB）則是指在耐多藥結(jié)核病的基礎(chǔ)上，對(duì)二線藥物中的氟喹諾酮類(lèi)藥物以及3種二線抗結(jié)核注射劑（卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星）中的至少一種耐藥。MDR－TB和XDR－TB的不斷增多，使得快速、可靠地對(duì)二線抗結(jié)核藥物的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)的需求更加迫切。

常用的注射類(lèi)二線抗結(jié)核藥物主要有氨基糖苷類(lèi)抗生素（卡那霉素、阿米卡星）和多肽類(lèi)抗生素（卷曲霉素）。通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)進(jìn)行耐藥檢測(cè)是目前普遍采用的方法，包括比例法和絕對(duì)濃度法[1]。但由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢而使藥敏試驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)，通常需要4－6周，延誤患者治療?；诜肿由飳W(xué)的耐藥檢測(cè)可以大大減少得到藥敏結(jié)果的時(shí)間，如線性探針雜交法[2－3]、焦磷酸測(cè)序法[4]、DNA 測(cè)序法等。然而，這些基于PCR的方法均涉及PCR后處理，易引起PCR產(chǎn)物污染造成假陽(yáng)性結(jié)果，且操作復(fù)雜，需要具備專業(yè)背景的技術(shù)人員。

基于實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的探針熔解曲線法將擴(kuò)增和檢測(cè)合二為一，無(wú)PCR后處理，具有快速、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，在突變檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)上的應(yīng)用也引起人們極大興趣[5－11]。注射類(lèi)二線藥的耐藥主要由點(diǎn)突變引起，適合采用探針熔解曲線法進(jìn)行檢測(cè)。卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素的耐藥機(jī)制存在交叉耐藥現(xiàn)象，主要是由rrs基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致，3種藥的耐藥株中發(fā)生該基因突變的比例分別為25%～40%、95%和70%～80%，包括rrs1401A→G、rrs1402C→T和rrs1484G→T等位點(diǎn)。另外，rrs1473G→A／T的突變導(dǎo)致部分卷曲霉素的耐藥。60%～80%的卡那霉素耐藥株在eis基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生突變，主要有－10G→A、－14C→T和－37G→T等突變類(lèi)型[12－15]。

本研究利用廈門(mén)致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌注射類(lèi)二線藥耐藥突變檢測(cè)試劑盒（探針熔解曲線法）MeltPro TB／SL對(duì)241份結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行注射類(lèi)二線藥耐藥相關(guān)突變檢測(cè)，并對(duì)該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)性能的考察。

1 材料與方法

1.1 結(jié)核分枝桿菌注射類(lèi)二線藥耐藥突變檢測(cè)試劑盒MeltPro TB／SL試劑盒由廈門(mén)致善生物科技股份有限公司提供。試劑盒采用探針熔解曲線法檢測(cè)，使用雙管雙色體系檢測(cè)rrs基因（1401、1402、1473和1484位點(diǎn)）、eis基因啟動(dòng)子區(qū)（－10、－14和－37位點(diǎn)）的突變。包括提取體系（TB DNA提取液）、擴(kuò)增體系（PCR反應(yīng)混合液A、B和酶混合液）以及對(duì)照體系（陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照）。

探針熔解曲線法的檢測(cè)原理基于野生型序列具有特定的熔點(diǎn)，基因突變會(huì)導(dǎo)致探針結(jié)合能力下降，導(dǎo)致熔點(diǎn)下降。根據(jù)熔點(diǎn)的變化即可判斷突變的有無(wú)。對(duì)于一份未知的待檢樣本，需要結(jié)合反應(yīng)體系A(chǔ)和B的FAM和HEX通道共4個(gè)檢測(cè)區(qū)域的結(jié)果，進(jìn)行整體的分析。結(jié)核分枝桿菌在4個(gè)檢測(cè)區(qū)域均應(yīng)存在野生型或突變型熔解峰，若有一個(gè)或一個(gè)以上檢測(cè)區(qū)域無(wú)熔解峰，則提示待檢樣本可能不是結(jié)核分枝桿菌或其濃度低于檢測(cè)限。

反應(yīng)程序：50。C2min；95。C10min；95。C10 s，71。C15s（每個(gè)循環(huán)下降1。C），78。C15s，循環(huán)10次；95。C10s，61。C15s（檢測(cè)熒光），78。C15 s，循環(huán)45次，熒光通道選用FAM和HEX。熔解分析程序：95。C2min；40。C2min；40。C～85。C，升溫過(guò)程中每1。C采集FAM和HEX通道熒光信號(hào)。

注射類(lèi)二線藥耐藥突變檢測(cè)分兩管在雙色實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行。一管檢測(cè)rrs基因突變，另一管檢測(cè)eis基因啟動(dòng)子區(qū)突變。PCR體系按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制，25μL檢測(cè)體系含20μL PCR反應(yīng)混合液和5μL模板DNA。

1.2 菌株來(lái)源及處理

1.2.1 臨床樣本 來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)樣本96份，均有卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素的藥敏信息；來(lái)自山東胸科醫(yī)院的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)樣本145份，無(wú)藥敏信息。

文獻(xiàn)[11]提出了基于余弦函數(shù)(記為COSGWO)和二次函數(shù)(記為2GWO)的非線性動(dòng)態(tài)變化收斂因子更新方法,更新公式為式(23)、式(24),仿真結(jié)果表明優(yōu)于基本GWO,且基于余弦函數(shù)和二次函數(shù)的收斂因子非線性動(dòng)態(tài)變化效果接近。

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用熱裂解法進(jìn)行基因組DNA的提?。喝颖镜臏缁罹?，與TB DNA提取液按照體積比1∶1混勻；99。C加熱20min；13 000 r／min離心10min，取上清作為模板。

1.2.2 非結(jié)核分枝桿菌 用于分析特異性評(píng)價(jià)的23株非結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株滅活菌液由中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室提供。23株菌濃度為1×106個(gè)菌／mL，包括：鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、胃分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、施氏分枝桿菌、次要分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、猿分枝桿菌、瘰癘分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、亞洲分枝桿菌?；蚪MDNA提取方法與臨床樣本的提取方法相同。

1.2.3 含不同耐藥突變的質(zhì)粒 用于突變檢出能力驗(yàn)證的12個(gè)質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其中包括2個(gè)野生型質(zhì)粒（分別對(duì)應(yīng)rrs基因和eis基因啟動(dòng)子區(qū)）以及10個(gè)突變型質(zhì)粒（1個(gè)野生型多態(tài)性eis－12C＞T，9個(gè)耐藥突變r(jià)rs1401A＞G、rrs1402C＞T、rrs1473G＞A、rrs1473G＞T、rrs1484G＞T、eis－37G＞T、eis－14C＞T、eis－13A＞G、eis－10G＞A）。使用 E.Z.N.A.TMPlasmid Miniprep Kit（Omega Bio－tek，美國(guó)）進(jìn)行質(zhì)粒的提取。使用分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定，根據(jù)質(zhì)粒長(zhǎng)度進(jìn)行拷貝數(shù)的計(jì)算。

1.2.4 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株 用于最低檢測(cè)限考察的H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株滅活菌液由深圳市慢性病防治中心提供，使用 TIANamp Bacteria DNA Kit（TIANGEN BIOTECH，北京）進(jìn)行基因組DNA提取和純化。之后使用分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CFX 96實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio－Rad，美國(guó)）；GenePro基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司，中國(guó)）；ND－1000紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；5451D臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；CHB－100恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆袊?guó)）。

1.4 突變檢出能力考察 使用TB DNA提取液將定量好的質(zhì)粒進(jìn)行稀釋，得到濃度為1×104拷貝／μL的模板。同時(shí)以滅菌超純水作為空白對(duì)照。

1.5 最低檢測(cè)限考察 使用TB DNA提取液將定量好的H37Rv基因組DNA進(jìn)行稀釋，依次得到濃度為1×105拷貝／μL、1×104拷貝／μL、1×103拷貝／μL、1×102拷貝／μL、1×101拷貝／μL、1×100拷貝／μL的模板。每管加入5μL作為模板，同時(shí)以滅菌超純水作為空白對(duì)照。

1.7 分析特異性考察 以中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室提供的23株非結(jié)核分枝桿菌提取的DNA為模板，考察該試劑盒的分析特異性。同時(shí)以滅菌超純水作為空白對(duì)照。

1.8 樣本檢測(cè) 使用241份臨床樣本進(jìn)行試劑盒的臨床評(píng)價(jià)。所有檢測(cè)為突變的樣本、疑似不均一耐藥的樣本以及與藥敏結(jié)果不符的樣本均進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序由華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

2 結(jié) 果

2.1 使用質(zhì)粒進(jìn)行突變檢出能力的考察 為考察該試劑盒能否將注射類(lèi)二線藥耐藥相關(guān)突變與野生型進(jìn)行區(qū)分，使用具有不同突變類(lèi)型的質(zhì)粒進(jìn)行考察。結(jié)果如表1。

結(jié)果顯示，各耐藥突變與野生型的熔點(diǎn)差異均在3.0。C以上，突變型均能和野生型相區(qū)分。部分情況下無(wú)法判斷具體的突變類(lèi)型（rrs1473G＞A和rrs1473G＞T；eis－14C＞T、eis－13A＞G 和eis－10G＞A），但這兩種情況下不同突變的發(fā)生都導(dǎo)致試驗(yàn)菌株對(duì)CAP或KAN耐藥，因此不影響對(duì)試驗(yàn)菌株耐藥性的判斷。

2.2 最低檢測(cè)限考察結(jié)果 最低檢測(cè)限考察的結(jié)果顯示，不同濃度的模板對(duì)應(yīng)的4個(gè)檢測(cè)通道的Tm值均一而穩(wěn)定。當(dāng)野生型模板濃度為5拷貝／反應(yīng)時(shí)，4個(gè)檢測(cè)通道均有相應(yīng)的熔解峰。結(jié)果表明，本體系的野生型最低檢出量可以達(dá)到5拷貝／反應(yīng)。

2.3 不同突變比例模板的考察結(jié)果 如圖1結(jié)果顯示，隨著突變比例的增加，熔解曲線逐漸由野生型峰向突變型峰偏移。在4個(gè)檢測(cè)通道中，突變比例為30%及以上時(shí)，熔解曲線的峰形較野生型有明顯的差異，可以與野生型峰進(jìn)行區(qū)分，從而判斷為不均一耐藥樣本。

2.4 分析特異性的考察結(jié)果 使用23種非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行該試劑盒的分析特異性考察，同時(shí)以H37Rv為對(duì)照。結(jié)果顯示，在反應(yīng)體系A(chǔ)的FAM和HEX通道，除H37Rv有熔解信號(hào)之外，部分非結(jié)核分枝桿菌有信號(hào)；在反應(yīng)體系B的FAM通道和HEX通道，除H37Rv有野生型熔解峰之外，23株非結(jié)核分枝桿菌和空白對(duì)照的結(jié)果一致，即反應(yīng)體系B對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的無(wú)交叉反應(yīng)。綜合兩個(gè)反應(yīng)結(jié)果，沒(méi)有任何一株NTM同時(shí)在兩個(gè)反應(yīng)中均有檢測(cè)信號(hào)，因此23種常見(jiàn)非結(jié)核分枝桿菌對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明該試劑對(duì)于上述NTM具有100%的分析特異性。

2.5 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室的培養(yǎng)樣本96份。

表1 不同突變質(zhì)粒與野生型的熔點(diǎn)差異Tab.1 ΔTmbetween wild－type and mutant plasmids

圖1 不同突變比例的模板考察的結(jié)果Fig.1 Detection of the mixed mutant and wild－type in different ratios

通過(guò)將試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與藥敏結(jié)果進(jìn)行對(duì)比（表2），可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于卡那霉素耐藥突變檢測(cè)，該試劑盒的靈敏度為90.0%，特異性為98.8%，總符合率為97.9%，kappa值為0.89；對(duì)于阿米卡星耐藥突變檢測(cè)，該試劑盒的靈敏度為80.0%，特異性為98.8%，總符合率為96.9%，kappa值為0.83；對(duì)于卷曲霉素耐藥突變檢測(cè)，該試劑盒的靈敏度為85.7%，特異性為96.6%，總符合率為95.8%，kappa值為0.73。

表2 探針熔解曲線結(jié)果與藥敏結(jié)果對(duì)比Tab.2 Results comparison between MeltPro TB／SL and phenotypic drug－susceptibility testing（DST）

從以上96份臨床樣本中共檢出10例突變樣本，測(cè)序結(jié)果表明，9例樣本發(fā)生rrs1 401A→G突變，1例樣本發(fā)生eis基因啟動(dòng)子區(qū)－10G→A突變。比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)卡那霉素耐藥而MeltPro TB／SL為野生的1例樣本，其測(cè)序結(jié)果也為野生型，與探針熔解曲線結(jié)果一致；比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)卡那霉素敏感而MeltPro TB／SL為突變的1例樣本，其測(cè)序結(jié)果為rrs1401A→G，與探針熔解曲線結(jié)果一致。比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)阿米卡星耐藥而MeltPro TB／SL為野生的2例樣本，其測(cè)序結(jié)果也為野生型，與探針熔解曲線結(jié)果一致；比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)阿米卡星敏感而MeltPro TB／SL為突變的1例樣本，其測(cè)序結(jié)果為rrs1 401A→G，與探針熔解曲線結(jié)果一致。比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)卷曲霉素耐藥而MeltPro TB／SL為野生的1例樣本，其測(cè)序結(jié)果也為野生型，與探針熔解曲線結(jié)果一致；比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)卷曲霉素敏感而MeltPro TB／SL為突變的3例樣本，其測(cè)序結(jié)果為rrs1401A→G，與探針熔解曲線結(jié)果一致?？偠灾?，測(cè)序結(jié)果與探針熔解曲線法的耐藥檢測(cè)結(jié)果完全一致。

2.5.2 山東胸科醫(yī)院的145份培養(yǎng)樣本 使用注射類(lèi)二線藥耐藥突變檢測(cè)試劑盒對(duì)145份樣本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)突變樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。熔解曲線分析為突變的樣本共9份，均為反應(yīng)體系A(chǔ)的FAM通道檢測(cè)突變，即rrs1 400區(qū)域的突變。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，所有9株突變類(lèi)型均為rrs1 401A→G突變。另外檢出1份不均一耐藥樣本，在反應(yīng)體系A(chǔ)的FAM通道檢測(cè)結(jié)果為雙峰。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，該樣本同時(shí)存在野生型菌株和突變類(lèi)型為rrs1 401A→G的突變型菌株。

3 討 論

簡(jiǎn)便高效、靈敏特異的耐藥診斷技術(shù)是結(jié)核病防控的有利工具，對(duì)于耐藥結(jié)核病的早期檢測(cè)、合理治療以及傳播控制都有重要的意義。目前針對(duì)一線抗結(jié)核藥物的耐藥檢測(cè)試劑有較多開(kāi)發(fā)和評(píng)價(jià)[6－11，16－17]，而針 對(duì) 注 射 類(lèi) 二 線 藥 的 耐 藥 檢 測(cè) 試 劑相對(duì)較少，專門(mén)針對(duì)注射類(lèi)二線藥的耐藥檢測(cè)試劑則近乎空白。商用試劑GenoType MTBDRsl（Hain Lifescience，德國(guó)）采用固相線性探針雜交原理，可檢測(cè)包括氟喹諾酮類(lèi)、乙胺丁醇以及氨基糖苷類(lèi)／多肽類(lèi)的耐藥性[2－3]。其中針對(duì)注射類(lèi)二線藥的耐藥性突變，該試劑僅針對(duì)rrs基因設(shè)計(jì)了2條突變型探針，而已知與注射類(lèi)二線藥耐藥相關(guān)的常見(jiàn)突變?cè)趓rs基因上有1 401、1 402、1 473和14 844個(gè)位點(diǎn)，在eis基因啟動(dòng)子區(qū)有－10、－14和－37 3個(gè)位點(diǎn)，顯然，該試劑盒檢測(cè)的突變數(shù)目嚴(yán)重不足。另外，就方法學(xué)而言，所采用的固相雜交法需要多步PCR后操作，不僅操作復(fù)雜繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)，且極易造成PCR產(chǎn)物的污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

本文考察的結(jié)核分枝桿菌注射類(lèi)二線藥耐藥突變檢測(cè)試劑盒（探針熔解曲線法）MeltPro TB／SL是目前唯一專門(mén)檢測(cè)注射類(lèi)二線藥物耐藥突變的試劑，覆蓋突變位點(diǎn)囊括了rrs基因的4個(gè)位點(diǎn)（1401、1402、1473和1484位點(diǎn)）和eis基因啟動(dòng)子區(qū)（－10、－14和－37位點(diǎn)）的3個(gè)位點(diǎn)上的所有突變類(lèi)型，設(shè)計(jì)檢測(cè)耐藥突變類(lèi)型共9個(gè)，大大超過(guò)了GenoType MTBDRsl檢測(cè)數(shù)目。在方法學(xué)上，MeltPro TB／SL是基于熒光PCR的探針熔解曲線法，屬于閉管檢測(cè)模式，檢測(cè)過(guò)程在實(shí)時(shí)PCR儀器上運(yùn)行，無(wú)PCR后處理步驟，不僅大大節(jié)約了時(shí)間（46個(gè)樣品從核酸提取到報(bào)告結(jié)果僅需約3h），也減少了PCR產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)。

從分析性能評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，MeltPro TB／SL可將10種突變類(lèi)型與野生型明確區(qū)分，最低檢出量低至5個(gè)拷貝的野生型基因組DNA，并且其熔解峰Tm值在較大范圍內(nèi)不受模板濃度影響。使用含有常見(jiàn)耐藥突變型的質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒按不同的比例混合后，當(dāng)突變比例為30%及以上時(shí)，熔解曲線的峰形相較于野生型有明顯的差異，可以與野生型區(qū)分，這一結(jié)果為檢測(cè)耐藥患者中的非均一耐藥提供了依據(jù)。分析特異性研究結(jié)果表明，在23株NTM中，部分NTM在rrs基因有檢測(cè)信號(hào)，這可能與rrs基因在這些NTM中保守度高有關(guān)，但所有菌株在eis基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)均無(wú)信號(hào)。對(duì)于任何一個(gè)待測(cè)樣本而言，其檢測(cè)結(jié)果需兩個(gè)反應(yīng)同時(shí)檢出信號(hào)，當(dāng)其中一個(gè)反應(yīng)無(wú)檢測(cè)信號(hào)時(shí)，就可以判斷該樣本非 MTB感染，上述結(jié)果證明了 MeltPro TB／SL高特異性。

從臨床性能評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，與傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗(yàn)相比，MeltPro TB／SL有較高的臨床靈敏度（卡那霉素為90.0%，阿米卡星80.0%，卷曲霉素85.7%），尤其是具有極高的臨床特異性（卡那霉素為98.8%，阿米卡星98.8%，卷曲霉素96.6%）。對(duì)于那些藥敏結(jié)果與突變檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，測(cè)序結(jié)果顯示其突變信息與MeltPro TB／SL結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了該試劑檢測(cè)突變的可靠性。這些藥敏與突變信息不一致的樣本，或者存在其它的耐藥突變機(jī)制，或者其藥敏試驗(yàn)的準(zhǔn)確性不夠，需更多的樣本驗(yàn)證。

總之，MeltPro TB／SL覆蓋位點(diǎn)廣，分析性能優(yōu)良，對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果與藥敏結(jié)果以及測(cè)序結(jié)果具有較高的一致性，并具有操作簡(jiǎn)便和檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)，作為一種新型結(jié)核分枝桿菌注射類(lèi)二線藥耐藥突變檢測(cè)的試劑，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有望為耐藥結(jié)核病的防控和治療提供快速高效的篩查手段。

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