小鼠青春期遭遇慢性溫和應(yīng)激對(duì)其成年后睡眠的影響

葉宸搏 羅艷佳 孫煥欣 楊素榮

（復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系 上海 200032）

人的一生中約1／3的時(shí)間在睡眠中度過，良好的睡眠能夠消除疲勞、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)生長發(fā)育、延緩衰老、增強(qiáng)記憶［1－3］。青春期是童年到成年過渡的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)大腦發(fā)育至關(guān)重要。此時(shí)期睡眠限制可能永久性改變大腦發(fā)育［4］。我們之前研究發(fā)現(xiàn)慢性睡眠限制降低青春期動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力［5］。青春期也是應(yīng)激敏感性的關(guān)鍵時(shí)間窗［6］，青春期遭遇應(yīng)激增加了成年后的焦慮樣行為［7］。但青春期遭遇慢性溫和應(yīng)激（chronic mild stress，CMS）對(duì)成年后睡眠行為的影響尚未見報(bào)道。

研究表明，與應(yīng)激相關(guān)的精神障礙常伴有睡眠異常。其中，睡眠潛伏期延長、早醒等被認(rèn)為與抑郁相關(guān)［8－9］。焦慮患者抑郁發(fā)病率提高［10］，但焦慮的睡眠問題尚不清楚。應(yīng)激通常被視為擾亂睡眠的主要因素，許多關(guān)于應(yīng)激與睡眠關(guān)系的研究都是基于動(dòng)物模型。針對(duì)急性應(yīng)激對(duì)睡眠的研究常使用單一方式一次性給予強(qiáng)烈應(yīng)激，例如水浸［11］、乙醚暴露［12］、足底電擊［13］等。而針對(duì)慢性應(yīng)激對(duì)睡眠的研究?；谥貜?fù)的較溫和應(yīng)激，例如間歇足底電擊［14］，長期交替給予不同的厭惡性刺激（傾斜籠子，食物剝奪，濕籠）［15］。以上方法所述的無論急性應(yīng)激還是慢性應(yīng)激對(duì)動(dòng)物刺激較強(qiáng)烈，尤其慢性應(yīng)激中長期交替給予不同的厭惡性刺激致使應(yīng)激因素較多，有一定局限性。在嚙齒動(dòng)物中，青春期被認(rèn)為在出生后21～59天［16］。本研究采用出生后28天（postnatal days 28，PND28）小鼠，使用之前報(bào)道方法［17］進(jìn)行溫和慢性應(yīng)激，此方法壓力源單一且溫和，用于模擬青少年在日常生活中的慢性溫和壓力，成年后利用腦電（electroencephalogram，EEG）記錄、高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）、自主活動(dòng)（locomotor activity，LA）等方法檢測(cè)動(dòng)物行為。目的是探討青春期CMS對(duì)成年后睡眠和情緒的影響，為青少年健康成長提供客觀參考。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)3周齡雄性C57BL／6J小鼠（簡(jiǎn)稱“C57小鼠”，中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（滬）2007－2005）。小鼠購入后，飼養(yǎng)在恒溫（24±1）℃、恒濕60%±2%、隔音、12 h／12 h明暗周期（光照度≈100 lux，7：00開燈，19：00關(guān)燈）的環(huán)境中1周后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中盡量減少動(dòng)物痛苦，實(shí)驗(yàn)方案得到復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理委員會(huì)同意。

主要儀器和軟件 腦立體定位儀（68002，深圳市瑞沃德生命科學(xué)有限公司）；自主活動(dòng)檢測(cè)儀器、睡眠覺醒生物解析系統(tǒng)（Biotex，日本kissei Comtec株式會(huì)社）；腦電波數(shù)據(jù)分析軟件（SleepSign＠3．0，日本），ANY－maze視頻追蹤系統(tǒng)（美國Stoelting公司）。

動(dòng)物分組 將42只C57小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和CMS組。造模結(jié)束后隨機(jī)分為兩批，一批埋置電極用于記錄小鼠自發(fā)睡眠覺醒狀態(tài)；另一批用于焦慮和自主活動(dòng)檢測(cè)。每組9～11只。

CMS模型的建立 模型組小鼠被單個(gè)放入束縛器進(jìn)行束縛5 min（14：00～16：00），連續(xù)28天（PND28～55），對(duì)照組小鼠每天在同一時(shí)間放置在模型組小鼠旁使其自由活動(dòng)5 min（圖1B）。束縛器由有機(jī)玻璃管（長100 cm，內(nèi)徑24 cm）及可調(diào)節(jié)的有機(jī)玻璃塞組成，在束縛器前端留有直徑為1 cm的小孔供小鼠呼吸。束縛時(shí)通過有機(jī)玻璃塞調(diào)節(jié)管體長度，使模型組小鼠恰好不能活動(dòng)。

電極埋置及腦電記錄 小鼠造模結(jié)束后第1天（PND56）進(jìn)行記錄電極埋置手術(shù)（圖1B）。在水合氯醛（360 mg／kg，i．p．）麻醉下，剃去小鼠頭頸部毛發(fā)并將其固定在腦立體定位儀上，75%酒精清潔手術(shù)區(qū)。EEG電極為2個(gè)直徑為1mm的不銹鋼螺絲，分別埋置在前囟前1．0mm，旁開1．5 mm，和后囟前1．0mm，旁開1．5 mm的位置。兩根肌電（electromyogram，EMG）電極分別插入頸部兩側(cè)的斜方肌內(nèi)，最后將連接電極的微型插頭用牙托粉固定在小鼠頭骨上，涂撒青霉素鈉，縫合創(chuàng)口。隨后將小鼠放置在37℃恒溫電熱板上至自然蘇醒后放入恢復(fù)籠中飼養(yǎng)。術(shù)后恢復(fù)7天后，小鼠被單獨(dú)接入睡眠記錄系統(tǒng)的記錄箱中，適應(yīng)記錄系統(tǒng)3天，連續(xù)記錄24 h EEG和EMG，用于睡眠覺醒研究。

EEG／EMG解析 待EEG／EMG記錄完成后，使用SleepSign解析軟件（日本Kissei Comtec株式會(huì)社）按照設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)（圖1A）以10 s為基本單位進(jìn)行自動(dòng)掃描并判定出覺醒W（wake）、非快動(dòng)眼睡眠S（non－rapid eye movement sleep，NREM）和快動(dòng)眼睡眠R（rapid eye movement sleep，REM）。進(jìn)行人工核查，必要時(shí)修正［18］。根據(jù)判別標(biāo)準(zhǔn)，NREM（S）時(shí)，EEGδ波（0．5～5 Hz）占優(yōu)勢(shì)，波幅大，EEG安靜；REM（R）時(shí)，EEGθ波（6～9 Hz）占優(yōu)勢(shì)，波幅較小，EMG最安靜；覺醒（W）時(shí)，EEG波幅最小，EMG活躍。

圖1 Sleepsign軟件解析標(biāo)準(zhǔn)（A）及實(shí)驗(yàn)流程圖（B）Fig1 Analysis standard for Sleepsign（A）and schematic chart of the timeline for CMS exposure and behavioral tests（B）

EMP檢測(cè) 小鼠焦慮行為使用EMP進(jìn)行檢測(cè)。小鼠造模結(jié)束后第12天（PND67）用EPM檢測(cè)小鼠焦慮行為（圖1B）。該裝置是由黑色有機(jī)玻璃制成的4個(gè)相互垂直的等距離長度的臂（長36 cm，寬6 cm，離地面高75 cm）和中央?yún)^(qū)域（6 cm×6 cm）組成。其中，閉臂擋板高度為19 cm。裝置被劃分為5個(gè)區(qū)域：2個(gè)開臂，2個(gè)閉臂，1個(gè)中央?yún)^(qū)域。實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠頭朝開臂被單獨(dú)放在中央?yún)^(qū)域使其自由探索5 min，使用ANY－maze視頻追蹤系統(tǒng)以小鼠四肢全部進(jìn)入同一區(qū)域時(shí)才計(jì)為進(jìn)入該區(qū)域?yàn)榕袛鄻?biāo)準(zhǔn)，記錄小鼠在各個(gè)區(qū)域的活動(dòng)情況。每只動(dòng)物測(cè)試后用棉布蘸少量清水將各個(gè)臂徹底清洗并擦干以排除殘留氣味對(duì)小鼠行為的影響［19］。

自主活動(dòng)檢測(cè) 小鼠進(jìn)行EMP檢測(cè)后立即接入自主活動(dòng)檢測(cè)設(shè)備中使其適應(yīng)環(huán)境2天，隨后進(jìn)行24 h LA記錄（圖1B）。小鼠單獨(dú)置于28 cm×16．5 cm透明籠中，相鄰鼠籠間距離為14 cm，紅外線攝像頭固定于距籠底17．5 cm的正上方，采用破壞紅外光束法（infrared beam－breaking assays）檢測(cè)自主活動(dòng)。選擇5 min作為采集間隔點(diǎn)，用于記錄動(dòng)物活動(dòng)量。

結(jié) 果

CMS增加小鼠成年后的NREM睡眠小鼠睡眠覺醒時(shí)程圖顯示CMS小鼠在進(jìn)入開燈期第1 h（7：00～8：00）REM明顯減少，關(guān)燈期第1h（19：00～20：00）覺醒顯著減少（圖2A）。小鼠睡眠覺醒時(shí)相相關(guān)累積圖顯示CMS小鼠在開燈期（12 h）NREM 睡眠量顯著增加；關(guān)燈期（12 h）有NREM睡眠量增加趨勢(shì)；在整個(gè)節(jié)律周期（24 h），NREM睡眠量顯著增加且覺醒顯著減少（圖2B）。此結(jié)果表明小鼠青春期遭遇CMS降低了成年后剛進(jìn)入開燈期的深度睡眠和剛進(jìn)入關(guān)燈期的覺醒，NREM睡眠在開燈期及整個(gè)節(jié)律周期都顯著增加。

圖2 小鼠青春期遭遇CMS后在成年期睡眠覺醒時(shí)程圖Fig 2 CMS during adolescence induced alterations on time course（A）and amounts of sleep and wakefulness（B）in adulthood

CMS引起小鼠成年后睡眠覺醒片段次數(shù)改變和NREM睡眠深度降低 CMS小鼠在開燈期20 s短覺醒片段出現(xiàn)次數(shù)顯著減少（圖3A），而NREM睡眠在開燈期、關(guān)燈期及整個(gè)24 h節(jié)律周期都在～1 120 s長片段出現(xiàn)次數(shù)顯著增加（圖3A～C）。此結(jié)果與時(shí)相相關(guān)累積圖（圖2B）NREM睡眠增加保持一致，說明CMS小鼠NREM睡眠量增加是由于～1 120 s長片段的增加造成的。

NREM睡眠能譜分析顯示CMS小鼠在δ波段（0．5～5 Hz）百分比顯著降低，向δ（10～15 Hz）、β（16～23 Hz）高頻率段轉(zhuǎn)移（圖3D～E）。此結(jié)果說明小鼠青春期遭遇CMS引起成年后NREM睡眠深度降低。

CMS小鼠成年后在睡眠覺醒時(shí)相轉(zhuǎn)換后第1h內(nèi)引起睡眠覺醒結(jié)構(gòu)的改變 開燈期第1 h，CMS小鼠REM睡眠～128 s中片段次數(shù)顯著減少，NREM睡眠～256 s中片段次數(shù)顯著減少（圖4A）。REM睡眠平均持續(xù)時(shí)間有較明顯的減少趨勢(shì)（P＝0．05，圖4C）；睡眠覺醒狀態(tài)轉(zhuǎn)換次數(shù)都有減少趨勢(shì)，其中REM向覺醒轉(zhuǎn)換次數(shù)顯著減少（圖4D）。CMS小鼠關(guān)燈期第1 h NREM睡眠～560 s片段次數(shù)顯著增加（圖4B）。NREM睡眠平均持續(xù)時(shí)間有顯著增加（圖4C）。上述結(jié)果說明CMS小鼠開燈期第1 hREM睡眠總量的減少（圖2A）主要表現(xiàn)為中片段（～140 s）出現(xiàn)次數(shù)、平均持續(xù)時(shí)間（圖4A、C）減少；CMS小鼠而關(guān)燈期第1 h覺醒結(jié)構(gòu)無明顯減少（圖表未列出），但覺醒總量減少（圖2A），這種減少可能與此時(shí)期NREM睡眠在～560 s中片段出現(xiàn)次數(shù)顯著增加（圖4B）及平均持續(xù)時(shí)間明顯延長（圖4C）有關(guān)。

CMS使小鼠成年后產(chǎn)生焦慮樣行為和降低自主活動(dòng) 與造模前（PND28）相比，對(duì)照組小鼠在進(jìn)入成年期（P55）后體質(zhì)量顯著增加，CMS小鼠體質(zhì)量也存在相應(yīng)增加，但與對(duì)照組相比，CMS小鼠體質(zhì)量顯著減少（圖5A），此結(jié)果表明小鼠青春期遭遇CMS使其體質(zhì)量增長減慢。

圖3 小鼠青春期遭遇CMS后成年期睡眠覺醒片段出現(xiàn)次數(shù)（A、B、C）和NREM睡眠能譜分析（D、E）Fig 3 Episode number analysis of sleep－wake behavior（A，B，C）and power density analysis of NREM sleep（D，E）after CMS during adolescence in mice

圖4 小鼠青春期遭遇CMS在成年期睡眠覺醒時(shí)相轉(zhuǎn)換后第1h各階段睡眠覺醒結(jié)構(gòu)分析Fig 4 Episode numbers，mean durations and stage transition during the 1st h after light on／light off in mice suffering CMS during adolescent stage

造模后第12天（PND67）使用EMP進(jìn)行焦慮樣行為檢測(cè)。與對(duì)照組相比，CMS小鼠停留開臂時(shí)間及進(jìn)入開臂次數(shù)均顯著減少（圖5B），顯示青春期遭遇CMS使小鼠在成年后產(chǎn)生焦慮樣行為。

造模后第15天（PND70）檢測(cè)小鼠自主活動(dòng)。與對(duì)照組相比，CMS小鼠在開燈期、關(guān)燈期以及整個(gè)節(jié)律周期（24 h）自主活動(dòng)次數(shù)都顯著減少（圖5C）。時(shí)程圖顯示CMS小鼠在開燈后第1 h（7：00～8：00）、第8 h（14：00～15：00），熄燈后第1 h（19：00～20：00）、第3 h（21：00～22：00）、第5 h（23：00～24：00）、第9 h（3：00～4：00）活動(dòng)次數(shù)出現(xiàn)顯著減少（圖5D）。該結(jié)果顯示，青春期遭遇CMS使小鼠在成年后自主活動(dòng)次數(shù)明顯減少。

圖5 小鼠青春期遭遇CMS使其成年后產(chǎn)生焦慮樣行為（B）和自主活動(dòng)次數(shù)減少（C、D）Fig 5 CMS during adolescence produced anxiety－like behavior（B）and decreased locomotor activity（C，D）in adulthood

討 論

本研究對(duì)青春期小鼠進(jìn)行CMS模擬日常潛在壓力，探討此時(shí)期給予溫和應(yīng)激對(duì)成年后睡眠及情緒的影響。結(jié)果表明，青春期CMS使小鼠體質(zhì)量顯著減少，這與之前報(bào)道嚙齒類動(dòng)物在青春期對(duì)壓力引起的體質(zhì)量丟失更敏感一致［20］，提示青春期給予CMS可能影響了青春期到成年期身體的發(fā)育。

在臨床上，社交焦慮障礙患者（generalized anxiety disorder，GAD）常傾訴睡眠維持困難，睡后無恢復(fù)感［21］，但與正常人相比多導(dǎo)睡眠圖上卻未見差異［22－23］。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也未出現(xiàn)覺醒量的顯著增加，反而NREM睡眠有所增加。值得注意的是NREM睡眠深度卻顯著降低。此結(jié)果與臨床上GAD傾訴睡后無恢復(fù)感相一致。另外，我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CMS小鼠在睡眠覺醒時(shí)相轉(zhuǎn)換后第1 h存在顯著的睡眠障礙。在開燈期第1 h，REM睡眠平均持續(xù)時(shí)間的減少和中片段（～140 s）出現(xiàn)次數(shù)的減少使REM總量減少，說明CMS小鼠降低了此時(shí)期的深睡眠；在關(guān)燈期第1 h，CMS小鼠表現(xiàn)為覺醒量減少，覺醒結(jié)構(gòu)無明顯減少，這種減少可能與此時(shí)期NREM睡眠在～560 s出現(xiàn)次數(shù)顯著增加及平均持續(xù)時(shí)間明顯延長有關(guān)。此結(jié)果說明青春期給予慢性溫和應(yīng)激引起小鼠成年后進(jìn)入睡眠期（開燈期）時(shí)睡眠深度出現(xiàn)延遲，這與臨床上焦慮患者反應(yīng)睡眠潛伏期延長相一致；進(jìn)入活動(dòng)期（關(guān)燈期）時(shí)覺醒的降低與臨床上焦慮患者反應(yīng)蘇醒后精神欠佳相一致。與對(duì)照組相比，CMS小鼠自主活動(dòng)次數(shù)的減少和NREM睡眠增多相一致。

視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）常被稱為“晝夜節(jié)律生物鐘”，參與哺乳動(dòng)物一系列生理行為和活動(dòng)的調(diào)節(jié)。相關(guān)研究證實(shí)，大部分晝行性相關(guān)行為和生理機(jī)能受視交叉上核的節(jié)律基因調(diào)控［24］。而夜間自主活動(dòng)的降低和視交叉腹外側(cè)核活動(dòng)受抑制有關(guān)［25］。另有報(bào)道提出生物鐘可能促進(jìn)睡眠或覺醒［26，27］。長時(shí)間光照可破壞SCN活動(dòng)從而產(chǎn)生焦慮樣行為［28］。我們推斷青春期遭遇CMS小鼠在成年后出現(xiàn)焦慮樣行為、自主活動(dòng)減少、睡眠障礙，尤其在睡眠覺醒時(shí)相轉(zhuǎn)換后第1 h引起睡眠障礙與SCN特定神經(jīng)元的活動(dòng)異常相關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

當(dāng)今社會(huì)，青少年在日常生活中經(jīng)受各方面的潛在壓力。這種壓力可能對(duì)成年后的心理健康產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果表明，青春期遭遇CMS使小鼠成年后產(chǎn)生顯著的睡眠障礙和焦慮樣癥狀。此結(jié)果提示，減少青少年日常壓力或許能減輕成年后睡眠障礙及焦慮的發(fā)生率。

致謝 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系黃志力教授和曲衛(wèi)敏教授為本研究提供了實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)。

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