宏基因組技術(shù)在生物降解基因研究中的應(yīng)用

王樂

[摘要]宏基因組技術(shù)不僅在生物催化轉(zhuǎn)化及活性物質(zhì)篩選過程應(yīng)用廣泛，同時(shí)，該項(xiàng)技術(shù)在生物降解基因的研究中也具有明顯的優(yōu)勢。宏基因組技術(shù)的產(chǎn)生為我們研究未知微生物資源指明了方向。宏基因組技術(shù)可用于非培養(yǎng)微生物的基因鑒定，尤其是不穩(wěn)定或異生型化合物生物降解途徑所涉及的關(guān)鍵基因。利用宏基因組技術(shù)研究微生物降解基因的多樣性，主要包括基于序列及非序列的兩種分子生物學(xué)手段。

[關(guān)鍵詞]宏基因組技術(shù)；生物降解基因；研究中；應(yīng)用

宏基因組技術(shù)不僅在生物催化轉(zhuǎn)化及活性物質(zhì)篩選過程應(yīng)用廣泛，同時(shí)，該項(xiàng)技術(shù)在生物降解基因的研究中也具有明顯的優(yōu)勢。目前，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了880種化合物及中間產(chǎn)物、590種酶、340種微生物，并證實(shí)了140個(gè)代謝途徑、930個(gè)反應(yīng)過程等，而這些數(shù)據(jù)大多數(shù)來自過去40年問純培養(yǎng)技術(shù)的研究成果。純培養(yǎng)技術(shù)主要針對少數(shù)生長快且具有較強(qiáng)污染物降解能力的微生物，由于其存在一定的局限性，現(xiàn)代微生物學(xué)家致力于探索更為有效的方法來研究未知的微生物資源，宏基因組技術(shù)的產(chǎn)生為我們研究未知微生物資源指明了方向。宏基因組技術(shù)可用于非培養(yǎng)微生物的基因鑒定，尤其是不穩(wěn)定或異生型化合物生物降解途徑所涉及的關(guān)鍵基因。利用宏基因組技術(shù)研究微生物降解基因的多樣性，主要包括基于序列及非序列的兩種分子生物學(xué)手段。

1基于序列的方法檢測生物降解基因

通常，代謝酶在其活性中心均具有保守的氨基酸序列，這些序列編碼的酶可用于污染物及異生型化合物的生物降解或生物轉(zhuǎn)化?？梢岳没谛蛄邢嗨菩缘募夹g(shù)來鑒別具有相同或相似反應(yīng)的酶和基因，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)具有更強(qiáng)動(dòng)力學(xué)特性的生物降解酶。例如，利用兼PCR引物，從含水土層中獲得的多組分苯酚羥化酶單加氧酶基因，比其他同類酶具有更強(qiáng)、更持久的三氯乙烯降解能力。

2基于PCR技術(shù)檢測酶的多樣性

有研究表明，含有煤焦油的污染水樣中的細(xì)菌mIRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，用mahAc基因編碼的大亞基引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以獲得萘雙加氧酶的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，在不同生物體中雙加氧酶mRNA的基因序列相差高達(dá)21%，這可能是由于不同微生物具有不同的底物范圍和專一性酶造成的。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)從煤焦油污染的水體沉積物中擴(kuò)增類似于nahAc敲的基因序列，結(jié)果得到多種類似nahAc基因的序列，且其豐度與污染源的萘濃度有很大關(guān)系。

DNA指紋技術(shù)已被廣泛用于復(fù)雜群落的系統(tǒng)發(fā)育分析，但應(yīng)用該技術(shù)分析降解基因的多樣性還處于早期階段。該技術(shù)無需全基因測序，分析代謝基因的指紋圖譜就可揭示微生物的底物專一性及酶的降解過程。例如，基于DNA單鏈變性凝膠方法測定芳香類化，污染的樣品中兒茶酚2，3-雙加氧酶的多樣性，結(jié)果表明根據(jù)污染程度可以分離到不同豐度和多樣性的C230基因。結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，代謝基因的指紋圖譜將成為系統(tǒng)研究全基因序列及豐度的有力工具。

3熒光原位雜交標(biāo)記生物降解基因

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是通過熒光標(biāo)記的RNA探針對已固定的細(xì)胞進(jìn)行原位雜交，從而使轉(zhuǎn)錄過程可視化，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物鑒定等方面。目前，廣泛選擇無輻射的地高辛尿嘧啶三磷酸進(jìn)行標(biāo)記，用于高特異性抗體的檢測。而基于酪胺信號(hào)放大的FISH技術(shù)增強(qiáng)了熒光標(biāo)記酪胺的雜交信號(hào)。

利用基于序列的分子生物學(xué)方法我們檢測到了許多降解基因，但由于一個(gè)反應(yīng)往往是由多種酶共同催化完成的，基因保守序列的相似性并不能保證具有相同的功能。因此，利用保守基因序列的相似性來鑒別生物降解酶僅僅是研究的一個(gè)方面。

4基于非序列的方法檢測生物降解基因

4.1差異顯示

mRNA差異顯示法（DD）是一種根據(jù)特定條件下的誘導(dǎo)表達(dá)來鑒定基因的非序列檢測法，來自不同生長條件的細(xì)胞mRNA經(jīng)過用PT-PCR擴(kuò)增就可被區(qū)分開來。DD是一門新興的微生物學(xué)技術(shù)，但當(dāng)其應(yīng)用于揭示環(huán)境樣品的相關(guān)序列時(shí)仍具有局限性。這是因?yàn)榧?xì)菌的mRNA不像真核細(xì)胞那樣容易發(fā)生poly（A）到poIy（dT）的反轉(zhuǎn)錄。目前，DD技術(shù)已被用于檢測Rhodococcus erythropolis HLPM-1中有關(guān)2，4-冬硝基酚降解操縱子基因以及檢測混合培養(yǎng)基中的環(huán)己酮單加氧酶基因。此外，在經(jīng)甲苯誘導(dǎo)的土壤樣品中，利用DD技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種新型的基因序列。盡管DD技術(shù)需要分析大量的PT-PCR檢測反應(yīng)并排除假陽性，但它盡可能地為基因表達(dá)研究提供了一種非培養(yǎng)且不依賴于任何基因序列的有力方法。

4.2穩(wěn)定性同位素標(biāo)記

Meselson和StaM利用將原子結(jié)合到DNA可增加DNA的密度從而使復(fù)制后的父母與后代分離的原理，提出了DNA半保留復(fù)制假說。穩(wěn)定性同位素標(biāo)記（SIP）即應(yīng)用這一觀點(diǎn)在化合物中納入重原子，進(jìn)而從分解代謝該標(biāo)記化合物的活性微生物中分離出核苷酸。通過納入大量的穩(wěn)定同位素原子，造成標(biāo)記與未標(biāo)記樣品問的密度差異，利用密度梯度離心分離出含130核苷酸的微生物基因組。該分離得到的標(biāo)記核苷酸可以用于構(gòu)建宏基因文庫或作為PCR或PT-PCR的反應(yīng)模板。SIP的主要特點(diǎn)是能夠直接進(jìn)入活性生物體的核酸中，無需事先了解這些微生物在樣品中的存在性及豐度。另一種方法是使用溴脫氧尿苷（BrdU）來標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)在于能代謝BrdU的微生物的DNA可以與BrdU共沉淀。

應(yīng)用于環(huán)境生物學(xué)的各種新技術(shù)已越來越多地被用于揭示與生物降解和生物轉(zhuǎn)化相關(guān)的序列，以及其在自然環(huán)境中保持活性的條件。分析具有污染物代謝活性的群落的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系變得越來越重要，因?yàn)橄到y(tǒng)發(fā)育的微小變化都會(huì)引起生物降解特異性的改變。無論是對宏基因組進(jìn)行大規(guī)模的測序，還是利用宏基因組技術(shù)尋找具有生物降解潛能的基因，都將與純培養(yǎng)技術(shù)聯(lián)手共同開發(fā)生物降解功能的詳細(xì)信息，從而為工業(yè)化社會(huì)的持續(xù)發(fā)展開辟新的途徑。