結(jié)合分子模擬和網(wǎng)絡(luò)方法分析β2腎上腺素受體激活過程的構(gòu)象變化

肖秀嬋+華勇攀+高楠+　江源遠(yuǎn)+蒲雪梅+李夢龍

摘 要 順應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究的發(fā)展對構(gòu)象信息的需求，結(jié)合靶向分子動力學(xué)模擬和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)方法建立了對β2腎上腺素受體激活信號傳導(dǎo)相關(guān)的構(gòu)象變化的解析方法，通過分子動力學(xué)模擬獲取激活過程的構(gòu)象集合，并進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)分析方法去識別構(gòu)象變化過程中的關(guān)鍵殘基及關(guān)鍵路徑。結(jié)果表明，β2腎上腺素受體構(gòu)象變化是各個區(qū)域之間信號傳遞的綜合，跨膜螺旋的連接區(qū)域是信號傳遞的樞紐，螺旋兩端包括胞內(nèi)外Loop區(qū)域是信號傳導(dǎo)的核心區(qū)域。關(guān)鍵路徑分析發(fā)現(xiàn)，信號傳遞通路不止一條，都是從配體結(jié)合口袋殘基Ser204附近開始，分別傳遞到NPxxY區(qū)域和ICL2區(qū)域，其中螺旋Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ是信號傳遞的必經(jīng)區(qū)域，這些研究成果為β2AR激活信號傳導(dǎo)過程的闡明提供了重要的分子信息。

關(guān)鍵詞 β2腎上腺素受體； 激活過程； 構(gòu)象變化； 靶向分子動力學(xué)模擬； 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)； 關(guān)鍵殘基

1 引 言

蛋白質(zhì)具有柔性，其結(jié)構(gòu)在功能發(fā)揮過程中會發(fā)生相應(yīng)變化，而蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)只是一種靜態(tài)的平均結(jié)構(gòu)，并不能完全代表其發(fā)揮功效的構(gòu)象，因此對蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的分析已成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究的一個重要發(fā)展趨勢[1]。Lanucara等[2]利用離子遷移質(zhì)譜解析蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化動力學(xué)，為人們理解其功能提供了蛋白質(zhì)柔性和折疊機(jī)制的構(gòu)象信息；Burmann等[3]將高分辨率NMR用于大腸桿菌探針與配體作用的構(gòu)象變化動力學(xué)研究。此外，Kahsai等[4]提出了結(jié)合同位素標(biāo)記和質(zhì)譜法研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的分析方法，并用該方法成功揭示了一種重要靶標(biāo)蛋白受藥物配體誘導(dǎo)所引起的激活功能的構(gòu)象變化。上述工作清楚地展示了儀器分析方法用于蛋白質(zhì)構(gòu)象分析的發(fā)展新趨勢，以及構(gòu)象解析對一些新分析方法的需求。

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是最大的膜蛋白家族和藥物靶標(biāo)之一，由7個跨膜螺旋構(gòu)成，在信號傳導(dǎo)過程中具有重要作用，是藥物研發(fā)中主要靶標(biāo)蛋白，目前市場上30%的藥物是以GPCRs為靶標(biāo)[5]。GPCRs主要是通過從非活性態(tài)到活性態(tài)的激活來發(fā)揮其信號功能，在其激活過程中，伴隨著明顯的構(gòu)象變化，因此，對激活過程中構(gòu)象變化的了解是闡明GPCRs激活機(jī)制這一信號功能的關(guān)鍵。然而，對于膜蛋白的解析難度導(dǎo)致GPCRs高分辨率晶體結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)缺乏，更加限制了其激活過程中構(gòu)象變化的分析。因此，有必要引入一些先進(jìn)的其它學(xué)科技術(shù)，協(xié)助實(shí)驗(yàn)解析其構(gòu)象變化的結(jié)構(gòu)信息。

分子動力學(xué)方法可以模擬出物質(zhì)在原子尺度上的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)行為的時間變化過程，因此已成為輔助實(shí)驗(yàn)研究蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）變化的一種有效方法[6，7]。實(shí)驗(yàn)研究已揭示GPCRs激活過程時間在ms～s級[8]，現(xiàn)有的計(jì)算機(jī)能力還難于采用平衡的分子動力學(xué)方法獲取GPCR的激活過程。靶向分子動力學(xué)模擬（TMD）是一種非平衡的分子動力學(xué)模擬，可以借助外力加速蛋白質(zhì)從初始結(jié)構(gòu)到目標(biāo)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，在有限的時間內(nèi)能獲取蛋白質(zhì)功能過程中構(gòu)象變化空間，已成功應(yīng)用于一些涉及大的構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性能的研究中[9，10]。此外，分子動力學(xué)模擬軌跡中包含了眾多構(gòu)象，如何對這些大量構(gòu)象進(jìn)行有效的分析，以獲取其重要的關(guān)鍵區(qū)域及通路是解析與功能相關(guān)的構(gòu)象變化的關(guān)鍵。

復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)方法可以利用網(wǎng)絡(luò)的原理通過對節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)特征值和邊的分析給出體系中信號變化的重要信息，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)就是采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)方法對蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其中以氨基酸為頂點(diǎn)，以氨基酸之間的相互作用為邊構(gòu)建的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可以將復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以一種全新的網(wǎng)絡(luò)形式描述，而且也可將分子動力學(xué)模擬軌跡所得的每個構(gòu)象視為節(jié)點(diǎn)，而構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系就是網(wǎng)絡(luò)的邊，由此構(gòu)建的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)可以有效并快速地獲取蛋白質(zhì)動態(tài)變化中的氨基酸特征以及變化通路，這類蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析方法已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[11]，蛋白質(zhì)折疊機(jī)制[12，13]以及蛋白質(zhì)相互作用[14]等方面的研究。

基于上面的研究背景，選擇β2腎上腺素能受體（β2AR）作為研究對象，該受體是2007年解析出的人類第一個GPCR受體，其對肌肉平滑肌、支氣管哮喘和喘息性支氣管炎都有重要的調(diào)節(jié)作用[15，16]。首先采用靶向分子動力學(xué)模擬方法來獲取β2AR從非活性狀態(tài)到活性狀態(tài)的激活過程的構(gòu)象變化過程，再結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的方法來識別和揭示β2AR的激活過程中的關(guān)鍵殘基以及關(guān)鍵通路，為闡明GPCR基于激活的信號傳導(dǎo)機(jī)制提供有價值的分子信息。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 初始結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

非活性和活性狀態(tài)的初始坐標(biāo)分別來自X-ray解析所得的β2AR晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID分別為2RH1和3SN6[17，18]。為了保證模擬環(huán)境真實(shí)性將去掉了所有非受體分子得到的2個apo受體[19]放入已構(gòu)建好的磷脂雙層膜POPC中，添加TIP3P水分子，分別構(gòu)建了非活性態(tài)和活性態(tài)兩個體系。

2.2 靶向分子動力學(xué)模擬

β2AR是由AMBER03力場描述，磷脂分子由GAFF（General amber force filed）力場描述[20]。TMD模擬采用的是NPT系綜，在Amber12程序[21]的Sander模塊中實(shí)現(xiàn)的，該方法用了一個標(biāo)準(zhǔn)的分子動力學(xué)勢能和一個與時間相關(guān)的限制勢能UTMD：

UTMD=12NK（RMSD-p（t）2）（1）

其中，N是RMSD值計(jì)算中所包含的原子數(shù)量，K是力常數(shù)，RMSD等于模擬結(jié)構(gòu)初始和最終狀態(tài)之間的RMSD值，ρ（t）是模擬體系在時間t時相對于目標(biāo)構(gòu)象的RMSD值。在本研究中，TMD模擬的初始坐標(biāo)分別是上面所得非活性態(tài)和活性態(tài)的坐標(biāo)。此外，NPT系綜的模擬在310 K下，壓力采用了1個大氣壓的周期邊界條件，SHAKE算法被用于限制所有與H相連的鍵長，其中限制的閾值為1.0×10

5[22]。非鍵相互作用的截?cái)嘀挡捎?0，Particle-Mesh-Ewald （PME） 方法[23]被用于處理長程的靜電相互作用。采用1 kcal mol1 2限制力和1 ns的模擬時間。MD模擬中步長為2 fs，且每隔1 ps保存了軌跡用于分析。endprint

2.3 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)方法

2.3.1 氨基酸網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于靶向分子模擬所得的5000個構(gòu)象，本研究采用現(xiàn)有研究中相同的方法（如下公式2和2）構(gòu)建氨基酸網(wǎng)絡(luò)[24]。在氨基酸網(wǎng)絡(luò)MCα中，以氨基酸Cα原子代表整個氨基酸并作為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)。邊的構(gòu)建方法：當(dāng)任意一對氨基酸的Cα原子之間的歐幾里得距離dCαij≤7時[24]，兩個節(jié)點(diǎn)之間添加一條邊。

dCαij=3（2）

MCαij={1， dCαij≤7， i≠j

0 其它（3）

2.3.2 網(wǎng)絡(luò)特征的挑選

主要分析了氨基酸在激活過程中度、接近中心性、介數(shù)和K-核的期望值。在各種不同的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦校?這4個特征常用來衡量網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的重要性和權(quán)威性。

度表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)連接的邊數(shù)，用k表示。度越大的節(jié)點(diǎn)說明該節(jié)點(diǎn)的鄰居比較多，在傳出信號時能夠快速地將信號轉(zhuǎn)發(fā)給多個接收者，并且能夠從多個方向接收信號。

接近中心性表示特定節(jié)點(diǎn)i到網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點(diǎn)的最短平均距離的倒數(shù)，簡稱接近數(shù)，用符號CCi表示，公式如下：

Li=1N（4）

CCi=LLi=N∑Nj=1（Lij）（5）

其中，Lij表示節(jié)點(diǎn)i和節(jié)點(diǎn)j之間的最短路徑長度。Li表示從節(jié)點(diǎn)i到網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)最短距離的平均值。Li值的大小能反映節(jié)點(diǎn)i在網(wǎng)絡(luò)中的相對重要性。Li越小，說明節(jié)點(diǎn)i距離網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)的平均距離更近，信號由節(jié)點(diǎn)i向網(wǎng)絡(luò)中其它節(jié)點(diǎn)傳播更為容易，速度更快，信號衰減更小。

介數(shù)g（i）是網(wǎng)絡(luò)中經(jīng)過節(jié)點(diǎn)i的最短路徑個數(shù)所占比例，介數(shù)值越大表明該節(jié)點(diǎn)是多條最短路徑的必經(jīng)之處，即該節(jié)點(diǎn)的樞紐通道能力很強(qiáng)。

K-核衡量了節(jié)點(diǎn)位于網(wǎng)絡(luò)中的層次，能夠從一定程度上衡量節(jié)點(diǎn)在氨基酸網(wǎng)絡(luò)中信號傳導(dǎo)的重要性。

3 結(jié)果與討論

3.1 靶向分子動力學(xué)模擬所揭示與激活信號傳導(dǎo)過程相關(guān)的構(gòu)象集合的分子信息

β2AR的實(shí)驗(yàn)研究表明從非活性態(tài)轉(zhuǎn)換到活性態(tài)是伴隨復(fù)雜的構(gòu)象變化的過程[15，25]。利用TMD方法模擬了β2AR從非活性態(tài)到活性態(tài)的變化過程（具體過程參照2.1和2.2節(jié)）。為了觀察受體整體結(jié)構(gòu)的變化情況分析了整個模擬過程中以非活性態(tài)晶體結(jié)構(gòu)為參照的結(jié)構(gòu)的RMSD值波動，結(jié)果如圖1所示，受體在激活過程中其構(gòu)象發(fā)生了很大的變化，在400 ps內(nèi)達(dá)到了活性態(tài)的結(jié)構(gòu)；在起始的100 ps內(nèi)，是接近非活性態(tài)的結(jié)構(gòu)，而在隨后的時間內(nèi)逐漸向活性態(tài)變化，最后達(dá)到完全活性態(tài)。

圖1 β2AR靶向分子動力學(xué)模擬過程中RMSD值隨時間的變化（）

Fig.1 Changes in RMSD values （in ） of β2 adrenergic receptor （β2AR） as a function of time in the 1 ns target molecular dynamics （TMD） simulation （）

3.2 基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析的激活過程中關(guān)鍵區(qū)域和關(guān)鍵殘基的識別

采用氨基酸網(wǎng)絡(luò)方法將靶向分子動力學(xué)模擬β2AR得到的5000個構(gòu)象構(gòu)建成相應(yīng)的5000個氨基酸網(wǎng)絡(luò)，分析了每個氨基酸在氨基酸網(wǎng)絡(luò)變化過程中網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鞯淖兓?，發(fā)現(xiàn)氨基酸的變化情況，進(jìn)而挖掘β2AR激活過程的信號傳遞中構(gòu)象變化的關(guān)鍵區(qū)域及關(guān)鍵殘基。

計(jì)算TMD構(gòu)象所構(gòu)建的5000個氨基酸網(wǎng)絡(luò)中每一個氨基酸的度期望值、接近中心性期望值，介數(shù)期望值和K-核期望值，將結(jié)果映射到β2AR氨基酸網(wǎng)絡(luò)中，圖2是網(wǎng)絡(luò)特征值的氨基酸網(wǎng)絡(luò)熱點(diǎn)映射圖。

圖2 β2AR氨基酸網(wǎng)絡(luò)。度期望值（a），接近中心性期望值（b），介數(shù)期望值（c），K-核期望值（d）的分布，紅色的點(diǎn)代表值較小，綠色的點(diǎn)代表值較大

Fig.2 Amino acid network of β2 adrenergic receptor. the degree expected value （a）， Closeness expected value （b）， betweenness expected value （c）， K-core expected value（d）. The distribution of red dots represents small values， green dots represent big values

從圖2a可見，在整個網(wǎng)絡(luò)分析中度期望值較大的節(jié)點(diǎn)遍及所有的區(qū)域，包括跨膜螺旋區(qū)域以及胞內(nèi)外Loop區(qū)，而度值越大的氨基酸的網(wǎng)絡(luò)鄰居越多，更容易將信號傳遞給更多的節(jié)點(diǎn)，圖中各個區(qū)域都有度值較大的殘基，說明受體各個區(qū)域之間信號傳遞有很高的相互關(guān)聯(lián)性。

圖2b是接近中心性的期望值，此值衡量了網(wǎng)絡(luò)中每一個節(jié)點(diǎn)與其余所有節(jié)點(diǎn)距離平均值的倒數(shù)，該網(wǎng)絡(luò)參數(shù)越大傳遞信號的能力越強(qiáng)，體現(xiàn)出殘基在構(gòu)象變化中的重要性。圖2b可見，接近中心性較大的殘基大多位于螺旋的中間部分，即連接區(qū)域，揭示了該區(qū)域可作為激活信號從配體結(jié)合口袋傳遞到G蛋白結(jié)合區(qū)域的樞紐區(qū)域。

介數(shù)描述的是一個網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)可能承載的信息流量，如果節(jié)點(diǎn)的介數(shù)越大，流經(jīng)它的信息就越多。從圖2c可見，螺旋Ⅱ，Ⅲ，V，Ⅵ及Ⅶ的介數(shù)值較大，配體結(jié)合口袋處殘基（Ala200，Ser203，Ser204，Ser207）以及NPxxY區(qū)域較為明顯，說明這些區(qū)域在信號傳遞中是必經(jīng)的氨基酸節(jié)點(diǎn)。

圖2d給出是K-核期望值，此值衡量了氨基酸在網(wǎng)絡(luò)中核心層次的位置，越接近核心位置的節(jié)點(diǎn)，相對信號越容易擴(kuò)散到網(wǎng)絡(luò)中的每一個節(jié)點(diǎn)，螺旋兩端的K-核最大，尤其是胞內(nèi)外loop區(qū)域（ECL2，ECL3，ICL2，靠近ICL3的殘基），說明在β2AR激活過程中胞內(nèi)外區(qū)域是核心，為受體激活中信號從胞外loop區(qū)傳到胞內(nèi)loop區(qū)的功能過程提供了進(jìn)一步的分子證據(jù)。

綜上所述， 在受體激活過程中度值，接近中心性值以及介數(shù)值最大的區(qū)域在配體結(jié)合口袋Ser204附近。此外，在胞內(nèi)區(qū)域網(wǎng)絡(luò)特征值最大的氨基酸節(jié)點(diǎn)并不明顯，而在受體激活過程中胞內(nèi)區(qū)域變化較大的螺旋Ⅲ和Ⅵ的K-核值特征明顯，體現(xiàn)了激活過程中螺旋Ⅲ和螺旋Ⅵ構(gòu)象變化的核心作用。這與一些實(shí)驗(yàn)研究[26]所指出的螺旋Ⅲ和螺旋Ⅵ是G蛋白偶聯(lián)受體激活的一個重要特征是一致的，為實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象提供了分子水平上的構(gòu)象證據(jù)，同時也表明了分子模擬的可靠性。

3.3 構(gòu)象變化的關(guān)鍵路徑分析

上面的分析已揭示了β2AR激活過程中的一些重要區(qū)域，本部分進(jìn)一步采用WebPSN[27]方法對整個激活過程的關(guān)鍵路徑進(jìn)行了分析。關(guān)鍵路徑分析算法的核心思想：在網(wǎng)絡(luò)中，存在一個起始狀態(tài)類、一個終點(diǎn)狀態(tài)類和若干中間狀態(tài)類（按照靶向動力學(xué)變化方向排列）。而每一條關(guān)鍵路徑必須從起點(diǎn)狀態(tài)到達(dá)終點(diǎn)狀態(tài)類，途中經(jīng)過每一個中間狀態(tài)的最短路徑。圖3顯示了信號從胞外傳遞到胞內(nèi)的激活通路的3種情況：

圖3 β2AR激活的關(guān)鍵通路及關(guān)鍵殘基。黃色小球代表氨基酸，綠色線代表路徑

Fig.3 The key residues and the critical pathways of β2AR during activation process. Yellow balls represent amino acids， green lines represent pathway

圖3a中可以看出信號從配體結(jié)合口袋處殘基Ser204開始，經(jīng)過螺旋Ⅴ→Ⅵ→Ⅲ→Ⅱ→Ⅳ，最后到達(dá)DRY區(qū)域以及胞內(nèi)ICL2區(qū)域；圖3b信號從配體結(jié)合口袋處殘基Ser203開始，經(jīng)過螺旋Ⅴ→Ⅲ→Ⅱ→Ⅳ，最后到達(dá)DRY區(qū)域以及胞內(nèi)ICL2區(qū)域；而圖3c信號從配體結(jié)合口袋處殘基Ser204開始，經(jīng)過螺旋Ⅴ→Ⅵ→Ⅲ→Ⅶ，最后到達(dá)NPxxY區(qū)域。

由此可知，信號從胞外傳遞到胞內(nèi)的過程中配體結(jié)合口袋為必經(jīng)的區(qū)域，且Ser204附近的殘基為關(guān)鍵氨基酸，與3.2節(jié)結(jié)果相同。從圖3還可見，受體激活通路并不止一條，圖3a和圖3b所展示的通路都是由配體結(jié)合口袋經(jīng)過連接區(qū)域不同的氨基酸到達(dá)高保守的DRY區(qū)域[28]，最終為ICL2區(qū)域上的Tyr141，而由活性態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)可知ICL2區(qū)域正是G蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域[28]，驗(yàn)證了結(jié)果的可靠性；圖3c所展示的是由配體結(jié)合口袋經(jīng)過連接區(qū)域到達(dá)NPxxY區(qū)域的，而NPxxY區(qū)域被實(shí)驗(yàn)研究指出是衡量G蛋白結(jié)合區(qū)域活性的關(guān)鍵區(qū)域[29]，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。這些研究結(jié)果表明， 受體激活過程中會激活胞內(nèi)不同區(qū)域，這應(yīng)該是導(dǎo)致受體可以與不同的G蛋白以及β-抑制蛋白結(jié)合的原因。此外，圖3還顯示，通路中間殘基大多位于螺旋Ⅲ，Ⅴ和Ⅵ上，與3.2節(jié)介數(shù)分布所給出的重要?dú)埢辔呛稀?/p>

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)采用靶向分子動力學(xué)模擬的計(jì)算手段獲取了重要的藥物靶標(biāo)蛋白β2AR在其信號傳導(dǎo)激活過程中的構(gòu)象變化的分子信息，并進(jìn)一步采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)方法對信號傳導(dǎo)過程中構(gòu)象變化的關(guān)鍵區(qū)域和關(guān)鍵路徑進(jìn)行了識別分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)β2AR激活是各個區(qū)域之間信號傳遞的綜合，跨膜螺旋的連接區(qū)域是信號傳遞的樞紐，螺旋兩端包括胞內(nèi)外Loop區(qū)域是信號傳導(dǎo)的核心區(qū)域。關(guān)鍵路徑分析發(fā)現(xiàn)信號傳遞通路不止一條，都是從配體結(jié)合口袋殘基Ser204附近開始，分別傳遞到NPxxY區(qū)域和ICL2區(qū)域，其中螺旋Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ是信號傳遞的必經(jīng)區(qū)域。這些研究結(jié)果為闡明G蛋白偶聯(lián)受體的功能機(jī)制提供了重要的分子信息，并進(jìn)一步展示了計(jì)算機(jī)模擬和網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析中的重要作用和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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