動(dòng)脈粥樣硬化患者尿液的代謝組學(xué)研究

龐博+越晧+王恩鵬+尉海濤+戴雨霖+劉淑瑩+吳綏生

摘 要 利用基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）患者和正常對(duì)照（Control）人群的尿液進(jìn)行分析，尋找動(dòng)脈粥樣硬化患者尿液中的差異代謝物，為其發(fā)病機(jī)制及早期篩查提供科學(xué)依據(jù)。使用VaSera VS-1000無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈血管彈性測(cè)定儀篩選15名動(dòng)脈粥樣硬化患者（46.84±2.41）及15名健康者（45.72±1.93），采用高分離度快速液相色譜與四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（RRLC-QTOF/MS）技術(shù)對(duì)其尿液代謝物進(jìn)行分析，采用主成分分析（Principal component analysis， PCA）對(duì)兩組代謝物進(jìn)行分類(lèi)，并尋找潛在生物標(biāo)記物。RRLC-QTOF/MS檢測(cè)結(jié)果表明，動(dòng)脈粥樣硬化組和對(duì)照組尿液代謝物譜能得到很好的區(qū)分，發(fā)現(xiàn)并鑒定了2種生物標(biāo)記物尿酸及胍基乙酸，從而提示嘌呤代謝、氨基酸代謝及氧化應(yīng)激可能在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

關(guān)鍵詞 動(dòng)脈粥樣硬化； 快速高分辨液相色譜/質(zhì)譜； 尿酸； 胍基乙酸； 代謝組學(xué)

1 引 言

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）是一種多器官受累的常見(jiàn)血管疾病，是許多心血管疾病的病理基礎(chǔ)，其發(fā)病率在我國(guó)乃至全世界呈逐年遞增趨勢(shì)[1]。動(dòng)脈粥樣硬化主要累及大型及中型肌彈力型動(dòng)脈，以主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈及腦動(dòng)脈為多見(jiàn)，多伴有結(jié)構(gòu)和功能上的改變，包括管壁結(jié)構(gòu)改變及血管舒縮功能障礙[2]。因此，其臨床診斷和治療一直備受關(guān)注，基礎(chǔ)與臨床工作者開(kāi)展了大量實(shí)驗(yàn)來(lái)尋求其早期診斷的指標(biāo)。目前臨床上最常用的是動(dòng)脈波傳導(dǎo)速度（Pulse wave velocity， PWV），用于反映動(dòng)脈粥樣硬化程度及早期診斷[3]，但尚缺乏臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方面的相關(guān)研究及生化指標(biāo)。

代謝組學(xué)（Metabonomics）[4，5]是研究生物體系受刺激或擾動(dòng)后其代謝產(chǎn)物-內(nèi)源性代謝物質(zhì)種類(lèi)、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)，它研究的是生物整體、系統(tǒng)或器官的內(nèi)源性代謝物質(zhì)的代謝途徑及其這些代謝物質(zhì)受到內(nèi)在或外在因素影響時(shí)所產(chǎn)生變化的規(guī)律，這種代謝變化可以通過(guò)先進(jìn)的分析技術(shù)（質(zhì)譜、核磁共振技術(shù)、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，表達(dá)成為特定的代謝指紋圖譜，并利用化學(xué)計(jì)量學(xué)的手段對(duì)這些信息進(jìn)行提取，挖掘其中有用的信息。代謝組學(xué)強(qiáng)調(diào)將人體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)來(lái)研究，其研究對(duì)象主要是各種生物體液，如尿液、血液、膽汁、唾液等[6]。通過(guò)測(cè)定人體各種體液內(nèi)代謝物的組成變化來(lái)認(rèn)識(shí)和反映人體代謝網(wǎng)絡(luò)在疾病或藥物作用下的變化規(guī)律。

本研究利用高分離度快速液相色譜與四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Rapid resolution liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry， RRLC-QTOF/MS）檢測(cè)經(jīng)使用VaSera VS-1000無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈血管彈性測(cè)定儀篩選的動(dòng)脈粥樣硬化患者尿液中代謝物的變化，通過(guò)主成分分析尋找潛在生物標(biāo)記物，結(jié)合血液生化指標(biāo)變化研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為早期篩查和早期臨床治療提供依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent1200快速分離液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent Technologies公司），配備高壓二元泵，控溫自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent 6520 Q-TOF質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent Technologies公司），配有ESI 離子源；Eppendorf 5804R 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

乙腈、甲酸（色譜純，美國(guó)TEDIA 試劑公司）；超純水（18.2 MΩ cm），由本實(shí)驗(yàn)Milli-Q 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）制備。

2.2 樣本來(lái)源

動(dòng)脈粥樣硬化患者尿樣和健康者尿樣均由吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供。通過(guò)使用VaSera VS-1000無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈血管彈性測(cè)定儀[7]以頸-股動(dòng)脈脈搏傳導(dǎo)速度（Carotid-femoral pulse wave velocity， C-F PWV）為主要指標(biāo)篩選15名動(dòng)脈粥樣硬化患者及15名健康者，具體情況見(jiàn)表1。所有人均清晨空腹采取尿樣，尿樣采集后在3000 r/min離心10 min，以除去雜質(zhì)，樣本于

80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣本處理

采用離心沉降后四倍稀釋法[8]，將樣本從80℃取出，室溫下溶解，離心（12000 r/min， 4℃， 5 min），取50 μL上清液，用水稀釋至200 μL，渦旋，以0.45 μm濾膜過(guò)濾，作為待測(cè)樣品供LC-MS分析。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm， 美國(guó)Agilent公司）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A： 超純水（0.1%甲酸）；流動(dòng)相B：乙腈；流動(dòng)相梯：0～5 min， 10%～30% B； 5～10 min， 30%-80% B； 10～12 min， 80%～85% B； 12～15 min， 85%～95% B； 15～20 min， 95% B； 20～21 min， 95%～100% B。流速：0.4 mL/min。

2.4.2 質(zhì)譜條件 分別采用電噴霧正離子模式（ESI+）和負(fù)離子模式（ESI-）對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1200；干燥氣流量（N2）為9 L/min；干燥氣溫度為 250℃；霧化電壓為0.276 MPa；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；碎裂電壓為150 V；錐孔電壓為65 V。在樣品測(cè)試之前，使用調(diào)諧液校正質(zhì)量軸。

2.5 數(shù)據(jù)處理：

尿液樣品用RRLC/MS進(jìn)行檢測(cè)，得到樣品的總離子流色譜圖，在Mass Hunter 軟件的分子特征識(shí)別模式下，進(jìn)行峰校準(zhǔn)、背景扣除、面積歸一化和數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化處理，將結(jié)果轉(zhuǎn)化為包含化合物的保留時(shí)間和質(zhì)荷比信息的CEF格式文件。將CEF 格式文件導(dǎo)入Mass Profiler Professional （MPP， Agilent Technologies， USA）軟件，統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行濾噪和歸一化，并進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis， PCA），其目的在于對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)壓縮，將多維的數(shù)據(jù)壓縮成幾個(gè)主要的主成分（PCs）來(lái)描述數(shù)據(jù)內(nèi)部的特征。本實(shí)驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，通過(guò)PCA 得分圖（Score plot）獲得樣本分類(lèi)信息，通過(guò)PCA 載荷圖（Loading plot）發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)記物的化合物，最終找出潛在的生物標(biāo)記物并進(jìn)行鑒定。endprint

3 結(jié)果與討論

3.1 動(dòng)脈粥樣硬化患者和健康者尿液LC-MS總離子流圖

尿液樣品經(jīng)RRLC-QTOF/MS分別在正離子模式和負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)分析。隨機(jī)選取一個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化患者和健康者的尿液經(jīng)過(guò)LC-MS分析得到總離子流圖（Total ion current， TIC）如圖1所示。從總離子流圖中直觀觀察，可以發(fā)現(xiàn)在正負(fù)離子模式下，有一些峰在二者之間存在著明顯差異，這些觀測(cè)結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義還需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析驗(yàn)證。

圖1 動(dòng)脈粥樣硬化患者和健康者的LC-MS總離子流

Fig.1 LC-MS total ion current chromatograms of urine samples deriving from atherosclerosis （AS） patients and healthy persons

正離子模式下：A 健康者尿樣，B 動(dòng)脈硬化患者尿樣；負(fù)離子模式下：C 健康者尿樣；D 動(dòng)脈硬化患者尿樣。

ESI+： healthy person （A）， AS patient （B）； ESI-： healthy person （C）， AS patient （D）.

3.2 數(shù)據(jù)分析結(jié)果

3.2.1 主成分分析（PCA） 采用主成分分析考察動(dòng)脈粥樣硬化患者和健康者尿樣代謝物變化。如圖2所示，正離子模式和負(fù)離子模式下的PCA得分圖能夠很好地區(qū)分二者。圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，每個(gè)樣本的位置由其自身的代謝決定，處于相同生理病理狀態(tài)的樣本通常具有相似的代謝物組成，因此在得分圖上也處于相似的位置，彼此之間距離越遠(yuǎn)，表示其生理病理狀態(tài)相差越大。在正離子模式下，前2個(gè)主成分可以解釋86%的變量，前3個(gè)主成分可以解釋95% 的變量；在負(fù)離子模式下，前2個(gè)主成分可以解釋84%的變量，前3個(gè)主成分可以解釋94%的變量。

3.2.2 差量變異研究 基于動(dòng)脈粥樣硬化患者和健康者的PCA分析結(jié)果，確定兩組之間存在代謝差異，這些變量的PCA 載荷圖如圖3所示，圖中每個(gè)點(diǎn)代表樣本中檢測(cè)到的代謝物相關(guān)信息，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明該代謝物對(duì)兩組間分類(lèi)的貢獻(xiàn)越大。根據(jù)載荷圖的結(jié)果，選取其中距離遠(yuǎn)點(diǎn)比較遠(yuǎn)，即對(duì)分組貢獻(xiàn)較大的代謝物作為潛在生物標(biāo)記物。根據(jù)獨(dú)立t檢驗(yàn)的p值，7種化合物被認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化人群發(fā)病的潛在標(biāo)記物。

圖3 區(qū)分AS組和Control組的PCA載荷圖。（a）正離子模式；（b）負(fù)離子模式。

Fig.3 Loadings plot from PCA for the common components. （a） ESI+；（b） ESI-

3.2.3 潛在標(biāo)志物鑒定 潛在標(biāo)記物的鑒定是根據(jù)它們的精確分子量和串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果以及與數(shù)據(jù)庫(kù)或標(biāo)準(zhǔn)品的比較進(jìn)行的。以負(fù)離子模式下的離子m/z 167.0184為例，說(shuō)明生物標(biāo)記物的鑒定過(guò)程。正離子模式下，該離子的提取離子色譜圖及在保留時(shí)間1.648 min時(shí)的質(zhì)譜圖如圖4a和圖4b所示。將計(jì)算結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物進(jìn)行比對(duì)，初步鑒定該化合物為尿酸。串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)果確認(rèn)了這個(gè)結(jié)論（圖4c），與購(gòu)買(mǎi)的標(biāo)準(zhǔn)品的串聯(lián)結(jié)果比對(duì)，兩者完全一致。根據(jù)以上信息，這個(gè)生物標(biāo)記物被鑒定為尿酸。其它化合物的鑒定同上所述，但是一些化合物未能定性。

圖4 潛在標(biāo)記物尿酸的鑒定：（a）正離子模式下尿酸的提取離子色譜圖； （b）相應(yīng)的質(zhì)譜圖； （c）串聯(lián)質(zhì)譜圖，碰撞能量為25eV。

Fig.4 Identification of potential marker-uric acid. （a） Extract ion chromatography （EIC）， （b） Mass spectrum of ion at m/z 167.0184 （c） MS-MS of the marker （25 eV）

表2列出了潛在生物標(biāo)記物的鑒定結(jié)果。ANOVA分析給出了它們?cè)诮】祵?duì)照組與AS組之間的變化趨勢(shì)。

3.3 動(dòng)脈粥樣硬化早期潛在生物標(biāo)志物分析

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用LS-MS方法對(duì)早期動(dòng)脈粥樣硬化患者和健康人群尿液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn)7種生物標(biāo)志物及其變化趨勢(shì)，并鑒定出其中4種，其中尿酸和胍基乙酸可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

在人體內(nèi)，嘌呤是核酸的代謝產(chǎn)物，尿酸是嘌呤的代謝最終產(chǎn)物，可以說(shuō)尿酸是細(xì)胞分解的終末產(chǎn)物之一，糖代謝、脂代謝紊亂均可導(dǎo)致尿酸增高。近年來(lái)，一些大規(guī)模前瞻性研究結(jié)果表明，尿酸參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而血尿酸濃度與動(dòng)脈粥樣硬化程度密切相關(guān)，是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。Krishnan等[10]報(bào)道，動(dòng)脈粥樣硬化的年輕人血管鈣化程度與尿酸濃度呈正比，Takayama等[11]報(bào)道，在無(wú)代謝綜合征的人群中，頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度隨尿酸濃度增加而增大。尿酸導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制有很多，在血液中尿酸的物理溶解度很低，尿酸微結(jié)晶容易析出并沉積于血管壁，引起局部炎癥，導(dǎo)致血管內(nèi)膜受損[12]。尿酸還可誘發(fā)氧化應(yīng)激，Chao等[13]發(fā)現(xiàn)通過(guò)NADPH氧化酶系統(tǒng)的氧化作用，尿酸可刺激人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮素基因-1的表達(dá)，從而參與心血管疾病發(fā)生發(fā)展；Gersch等[14]發(fā)現(xiàn)尿酸可直接滅活NO，從而發(fā)揮其促氧化作用，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。

胍基乙酸是一種甘氨酸的代謝中間產(chǎn)物，是肌酸生物合成的直接前體，在胍基乙酸-甲基轉(zhuǎn)移酶N的作用下生成肌酸，但這一反應(yīng)會(huì)造成高半胱氨酸（hcy）水平升高，而后者近年來(lái)已被證明是心血管疾病，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[15]。

動(dòng)脈粥樣硬化有很高的發(fā)病率，是各種心腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ)，對(duì)其早期篩查和診斷尤為重要。本實(shí)驗(yàn)在排除高血壓、血栓性疾病前提下，通過(guò)頸-股動(dòng)脈脈搏傳導(dǎo)速度（C-F PWV）這個(gè)指標(biāo)篩選出15名動(dòng)脈粥樣硬化患者與健康人，并觀察其尿液的代謝組學(xué)變化。經(jīng)過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析，健康對(duì)照組、動(dòng)脈粥樣硬化組獲得了很好的區(qū)分。本研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了兩種潛在生物標(biāo)記物：尿酸和胍基乙酸，其變化揭示了核酸代謝、氨基酸代謝在動(dòng)脈粥樣硬化早期發(fā)生發(fā)展中的作用，可能對(duì)于臨床上早期診斷、預(yù)防及治療動(dòng)脈粥樣硬化具有重要意義。endprint

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