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    刺五加葉藥物成分腦內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)及治療腦缺血作用的在線微透析—質(zhì)譜分析

    2015-11-16 18:26:15王倩倩張艷孟璐璐皮子鳳劉舒宋鳳瑞劉志強(qiáng)
    分析化學(xué) 2015年11期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)遞質(zhì)腦缺血質(zhì)譜

    王倩倩+張艷 孟璐璐+皮子鳳+劉舒+宋鳳瑞+劉志強(qiáng)

    摘 要 考察了刺五加葉中金絲桃苷和1,5-二咖啡酰奎寧酸入腦及腦內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)過程,同時(shí)評價(jià)刺五加葉對腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈構(gòu)建急性不完全性腦缺血模型,利用在線微透析-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,ACE 5 C18-AR液相色譜柱等度洗脫,MRM負(fù)離子模式下監(jiān)測金絲桃苷和1,5-二咖啡??鼘幩嵩诮】导叭毖笫竽X內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)差異,正離子模式檢測不同組別大鼠腦內(nèi)谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、乙酰膽堿(Ach)、5-羥色胺(5- )、多巴胺(DA)6種神經(jīng)遞質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在線方法線性良好(R2>0.99),準(zhǔn)確度、精密度滿足分析要求;金絲桃苷和1,5-二咖啡??鼘幩峋芡高^血腦屏障到達(dá)腦部,代謝迅速,在缺血大鼠腦內(nèi)吸收降低,消除加快;相比模型大鼠,預(yù)防性刺五加葉給藥7天后,缺血大鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu、Asp、GABA和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA的水平顯著降低(p<0.01),Ach水平顯著升高(p<0.05)。

    關(guān)鍵詞 刺五加葉; 腦缺血; 神經(jīng)遞質(zhì); 在線微透析-質(zhì)譜

    1 引 言

    腦血管病是威脅人類健康與生命的主要疾病之一,其中缺血性腦血管病占到了80%以上[1]。缺血發(fā)生時(shí),腦組織能量衰竭,出現(xiàn)線粒體功能紊亂、酸中毒、水腫、鈣泵失調(diào)等現(xiàn)象,繼而引發(fā)Ca2+超載、毒性自由基生成增多、神經(jīng)遞質(zhì)釋放失衡和細(xì)胞凋亡[2]。各因素間相互聯(lián)系,互為因果,形成瀑布樣級聯(lián)反應(yīng),嚴(yán)重?fù)p傷患者神經(jīng)系統(tǒng)。膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(DA)和5-羥色胺(5- )、興奮性氨基酸谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)和抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(GABA)在多項(xiàng)神經(jīng)生理活動(dòng)中發(fā)揮作用廣泛,表現(xiàn)活躍。這些神經(jīng)遞質(zhì)的體內(nèi)水平變化與多種神經(jīng)元功能紊亂與神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3 ~ 5]相關(guān)。

    刺五加系五加科植物刺五加[Acanthopanax senticosus (Rupr.et Maxim.)Harms]的干燥根和根莖或莖[6],其葉也可作藥用。研究表明,刺五加葉中含豐富的黃酮、皂苷及有機(jī)酸類活性成分,具有保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、降血壓、抑制CYP450活性等藥理作用[7]。文獻(xiàn)報(bào)道,刺五加葉中以金絲桃苷為代表的黃酮提取物對DPPH和·OH具有良好的清除能力[8]。有機(jī)酚酸1,5-二咖啡??鼘幩幔?,5-diCQA)可通過激活Erk激酶上調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng),減輕1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[9]。目前,關(guān)于刺五加葉治療實(shí)驗(yàn)性腦缺血的研究已有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn),刺五加葉皂苷能夠顯著改善腦缺血大鼠血液流變學(xué)及血小板功能異常[10],提高腦組織超氧化物歧化酶活性,降低丙二醛、Ca2+及乳酸水平[11];刺五加葉總黃酮聯(lián)合電針治療能提高B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白表達(dá),減少腦缺血區(qū)域細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12],但有關(guān)刺五加葉對缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)影響的研究還未見明確報(bào)道。本研究采用結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈構(gòu)建急性不完全性腦缺血模型[13],利用所搭建的微透析-質(zhì)譜在線分析平臺(tái)[14]實(shí)現(xiàn)正、負(fù)不同離子模式下對缺血大鼠腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)和外源性藥物成分的同時(shí)、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測,真實(shí)反映其在腦缺血病理狀態(tài)下的腦內(nèi)變化情況,簡化了樣品處理過程。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    ACQUITYTM UPLC系統(tǒng),Xevo TQ 三級四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司),ACE 5 C18-AR液相色譜柱(150 mm × 4.6mm)。微透析系統(tǒng):CMA 402灌注器推進(jìn)泵、CMA120動(dòng)物清醒活動(dòng)裝置、MAB6腦微透析探針(透析膜長4 mm,截留分子量15000 Da)、ASI腦定位儀、自組裝在線進(jìn)樣器。

    5-羥色胺(5- )、多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)和乙酰膽堿(Ach)均購于Sigma-Aldrich公司;金絲桃苷(Hyperoside,中國藥品生物制品檢定所);1,5-二咖啡??鼘幩幔?,5-diCQA,成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,批號:D090617);刺五加葉提取物(實(shí)驗(yàn)室制注射用凍干粉)。乙腈(HPLC級,F(xiàn)isher公司);乙酸(HPLC級,Tedia公司);超純水(Milli-Q系統(tǒng),Millipore公司)。人工腦脊液(aCSF,pH 7.4)由1.2 mmol/L CaCl2, 2.0 mmol/L Na2HPO4·12H2O, 1.0 mmol/L MgCl2, 2.7 mmol/L KCl和145 mmol/L NaCl 配制而成。

    2.2 實(shí)驗(yàn)過程

    2.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

    雄性Wistar大鼠(240~280 g)40只,隨機(jī)分為4組,分別為對照組、腦缺血模型組、刺五加葉給藥組(140 mg/kg),對照藥曲克蘆丁組(50 mg/kg),尾靜脈給藥,每日一次,以上劑量均按照人體臨床用藥劑量折算。給藥7天后于海馬區(qū)埋入探針套管,次日進(jìn)行腦缺血手術(shù)。為同時(shí)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究,缺血手術(shù)后按劑量給藥,并立即在線微透析采樣、檢測。

    微透析采樣:在大鼠海馬區(qū)(A: 5.6 mm,L: 4.6 mm,V: 4.6 mm)[15]埋入探針套管,次日插入腦探針,1.0 μL/min灌流aCSF平衡90 min,待腦缺血手術(shù)后立即采樣并在線檢測,采樣間隔20 min,連續(xù)采集180 min。

    急性不完全性腦缺血模型:大鼠以戊巴比妥鈉(40 mg/kg, ip)麻醉,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,雙線分別結(jié)扎,對照組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎。

    2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    精密稱取8種待測物對照品,金絲桃苷和1,5-咖啡??鼘幩嵋约状既芙?,神經(jīng)遞質(zhì)以超純水溶解,分別制成1.0 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。用aCSF-乙腈(4∶1, V/V)配制濃度為50.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。endprint

    2.2.3 色譜及質(zhì)譜條件

    色譜條件:柱溫為室溫;流動(dòng)相組成為20% A相(乙腈)和80% B相(0.5%乙酸溶液)等度洗脫,流速0.5 mL/min;進(jìn)樣量: 20 μL。

    質(zhì)譜條件:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,刺五加葉中2種成分在負(fù)離子(-)模式下檢測,6種神經(jīng)遞質(zhì)在正離子(+)模式下檢測,源溫150℃,毛細(xì)管電壓2.0 kV(-)/3.0 kV(+),脫溶劑氣溫度400 ℃(-)/350℃(+),脫溶劑氣流速800L/h(-)/700L/h (+)。各待測物質(zhì)譜參數(shù)見表1。表1 8種待測物的MRM質(zhì)譜參數(shù)

    3 結(jié)果與討論

    3. 1 方法學(xué)考察

    3. 1. 1 線性范圍及檢出限、定量限

    配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,外標(biāo)法定量,以待測物濃度為橫坐標(biāo),定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)得到各待測物線性回歸方程,所得相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,S/N≥3確定方法檢出限(LOD),S/N≥10確定定量限(LOQ),所得結(jié)果見表2。

    3.1.2 準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng) 選取各待測物線性范圍內(nèi)高、中、低濃度水平標(biāo)樣添加于人工腦脊液中,每個(gè)濃度重復(fù)5次,于3日內(nèi)測得日內(nèi)及日間準(zhǔn)確度(RE,%)和精密度(RSD,%)。結(jié)果表明,8種待測物的日內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度范圍分別在1.11%~10.80%和0.01%~14.40%,日間準(zhǔn)確度和精密度范圍分別為0.08%~14.82%和

    14.30%~0.26%,滿足生物樣品分析要求。

    在流動(dòng)相溶液A/B(1∶4, V/V)中添加高、中、低濃度對照品,制得溶劑標(biāo)樣;向空白大鼠腦透析液中同樣添加以上濃度對照品制,得基質(zhì)標(biāo)樣。空白大鼠腦透析液中含有一定濃度神經(jīng)遞質(zhì)待測物,基質(zhì)效應(yīng)(ME)的計(jì)算公式:

    ME(%)=(Amatrix-Asample)Astandard×100 (1)

    式中,Amatrix為基質(zhì)標(biāo)樣峰面積, Asample為腦透析液中待測物峰面積, Astandard為溶劑中標(biāo)樣峰面積。據(jù)此得到8種待測物的ME范圍在88.4%~113.6%之間,表明透析液基質(zhì)對待測物無明顯干擾。

    3.2 金絲桃苷和1,5-二咖啡??鼘幩崮X內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)分析

    利用微透析-質(zhì)譜在線分析平臺(tái)監(jiān)測了金絲桃苷和1,5-二咖啡??鼘幩?,比較二者在對照組及缺血大鼠腦內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)差異,并利用PKSolver軟件進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析。圖1為金絲桃苷和1,5-二咖啡??鼘幩岬哪X內(nèi)藥物濃度-時(shí)間曲線。

    由圖1可見,金絲桃苷和1,5-二咖啡??鼘幩崮軌蝽樌高^血腦屏障到達(dá)腦部,且代謝過程迅速,入腦后約0.5 h即達(dá)峰值,3 h內(nèi)基本代謝完全。表3列出了二者在對照組及腦缺血大鼠腦內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù), t1/2代表半衰期,Cmax 和tmax分別代表最大血藥濃度及達(dá)到此濃度的時(shí)間,AUC0-t代表零時(shí)間到最終采血點(diǎn)的濃度-時(shí)間曲線下面積,AUC0-inf_obs代表零時(shí)間到無限大時(shí)間的濃度-時(shí)間曲線下面積[16]。

    金絲桃苷和1,5-二咖啡??鼘幩岬乃幋鷦?dòng)力學(xué)參數(shù)在對照組及缺血大鼠腦內(nèi)呈現(xiàn)出了顯著變化。t1/2在臨床上多用于反映藥物從體內(nèi)消除速度的快慢,相比對照組,金絲桃苷和1,5-二咖啡??鼘幩嵩谌毖笫竽X內(nèi)的t1/2有所降低,表明二者在缺血大鼠腦內(nèi)消除速度加快;Cmax和tmax是反映藥物體內(nèi)吸收速率的兩個(gè)指標(biāo),AUC是評價(jià)藥物吸收程度的重要指標(biāo),給藥后約0.5 h藥物濃度即達(dá)峰值,說明二者能夠迅速透過血腦屏障到達(dá)腦部;二者在缺血大鼠腦內(nèi)的Cmax及AUC明顯降低,表明腦缺血的發(fā)生影響了刺五加葉中藥物成分的腦內(nèi)代謝,推測可能是大鼠腦缺血后血液流動(dòng)被阻斷或緩流,在缺血缺氧病理狀態(tài)下機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低導(dǎo)致。

    3.3 刺五加葉治療腦缺血的作用評價(jià)

    刺五加葉中有效成分能夠順利到達(dá)腦部,為進(jìn)一步探究其治療腦缺血的作用機(jī)制,利用所搭建的微透析-質(zhì)譜在線分析平臺(tái)同時(shí)檢測了對照組、腦缺血模型組、刺五加葉給藥組和曲克蘆丁組大鼠末次給藥后3 h內(nèi)海馬區(qū)6種神經(jīng)遞質(zhì)水平,經(jīng)前期測定的探針回收率[17]校正后,所得結(jié)果見圖2。

    由圖2可見,缺血引發(fā)了大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂,Glu,Asp,GABA,DA和5- 在缺血3 h內(nèi)海馬區(qū)水平顯著高于對照組(p<0.01),Ach水平顯著降低(p<0.01)。Glu與Asp是興奮性氨基酸(EAAs),尤其Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。Glu儲(chǔ)存于神經(jīng)元末梢的突觸囊泡中,以Ca2+依賴的方式釋放到突觸間隙中,正常狀態(tài)下,大部分Glu會(huì)經(jīng)再攝取重新回到細(xì)胞內(nèi),只有小部分發(fā)揮興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用,用于信號傳遞。但在腦缺血狀態(tài)下,大量Ca2+內(nèi)流,必然引發(fā)Glu的過度釋放使谷氨酸受體處于持續(xù)興奮狀態(tài),導(dǎo)致神經(jīng)元死亡,引發(fā)神經(jīng)毒性[18]。給藥刺五加葉大鼠在缺血后Glu水平顯著低于模型大鼠(p<0.01),推測可能是一定程度上緩解了Ca2+大量內(nèi)流,發(fā)揮了鈣通道阻滯劑的作用。GABA為主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),可以對突觸后神經(jīng)元起抑制保護(hù)作用,同時(shí)也可抑制突觸前神經(jīng)元Glu的釋放。本研究發(fā)現(xiàn),缺血大鼠腦內(nèi)GABA的水平顯著升高(p<0.01),推測可能是由于缺血早期Glu水平顯著升高,GABA發(fā)揮了代償性拮抗作用。但GABA的過度釋放也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GABA耗竭,使細(xì)胞內(nèi)源性抑制降低,神經(jīng)元興奮-抑制失衡,繼而引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡[19]。Ach是促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶、維持覺醒的重要神經(jīng)遞質(zhì)。通常在腦梗塞恢復(fù)期或多發(fā)性腦梗塞癡呆的治療方案中會(huì)增加Ach量以改善認(rèn)知能力[20]。DA和5- 是主要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),二者在缺血大鼠腦內(nèi)含量顯著增高,一方面,由于缺血時(shí)大量Ca2+內(nèi)流,導(dǎo)致其釋放量增加;另一方面,缺血引發(fā)腦內(nèi)能量耗竭遞質(zhì)重?cái)z取受阻,且降解單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的單胺氧化酶(MAO)活性降低。文獻(xiàn)[21]報(bào)道,單胺類神經(jīng)遞質(zhì)能夠?qū)θ毖窠?jīng)元造成直接損傷,并能促進(jìn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,增加N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)的敏感性,進(jìn)一步促進(jìn)Ca2+的大量內(nèi)流。預(yù)防性給藥刺五加葉提取物及陽性對照藥曲克蘆丁,缺血大鼠腦內(nèi)6種神經(jīng)遞質(zhì)的水平紊亂得到不同程度改善。刺五加葉中有效藥物成分迅速透過血腦屏障到達(dá)大鼠腦部發(fā)揮作用,顯著降低了缺血大鼠腦內(nèi)Glu、Asp、GABA和DA的水平(p<0.01),升高了Ach的水平(p<0.05)。相比對照藥曲克蘆丁,刺五加葉對氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)具有更好的調(diào)節(jié)作用。endprint

    以所測得的神經(jīng)遞質(zhì)含量作為統(tǒng)計(jì)變量,采用偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)通過得分圖對樣本進(jìn)行整體評價(jià)。在圖3中,橢圓區(qū)域代表95%置信區(qū)間內(nèi),每點(diǎn)代表一個(gè)生物樣本,對照組和腦缺血模型組間能夠明顯區(qū)分,表明缺血后大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)水平發(fā)生了顯著改變;刺五加葉及曲克蘆丁組能與缺血模型組良好區(qū)分,說明預(yù)防性給藥刺五加葉提取物及曲克蘆丁后能有效調(diào)節(jié)缺血引發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂,對缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷起到了保護(hù)作用。

    4 結(jié) 論

    刺五加葉中藥物成分金絲桃苷和1,5-二咖啡??鼘幩崮軌虺晒ν高^血腦屏障到達(dá)腦部發(fā)揮作用,并能夠有效緩解由缺血引發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)水平紊亂,尤其對氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì),其調(diào)節(jié)作用優(yōu)于陽性對照藥曲克蘆丁,表明刺五加葉具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究實(shí)現(xiàn)了對內(nèi)源性及外源性物質(zhì)在不同離子監(jiān)測模式下的同時(shí)、實(shí)時(shí)、連續(xù)檢測,從調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)角度研究了刺五加葉對腦缺血的治療作用,對開展藥效學(xué)及藥物代謝過程的體內(nèi)研究具有借鑒意義。

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