耐高糖米根霉菌株的生理特性

呂春微，徐 晴，陳 姣，李 霜

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

耐高糖米根霉菌株的生理特性

呂春微，徐 晴，陳 姣，李 霜

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

高糖發(fā)酵是提高產(chǎn)物濃度的常用方法，但天然菌株不能耐受高的糖濃度。為了解析高糖環(huán)境對(duì)菌株生理代謝的影響，以馴化獲得的耐高糖菌株和原始菌株為對(duì)象，研究不同糖濃度對(duì)二者生理特性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與原始菌株相比，耐高糖菌株細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的含量、胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）含量較高，且表現(xiàn)出更強(qiáng)的側(cè)系呼吸強(qiáng)度。在此基礎(chǔ)上，嘗試通過調(diào)節(jié)碳氮比（C/N）或添加甘氨酸的方式補(bǔ)足原始菌株的代謝不足。結(jié)果表明：在150g/L糖質(zhì)量濃度條件下，調(diào)節(jié)C/N為500時(shí)，原始菌株富馬酸產(chǎn)量可由37.4g/L增至40.2g/L。而添加0.5g/L甘氨酸，原始菌株富馬酸產(chǎn)量可以增至43.8g/L，提高了17.1%。

米根霉；富馬酸；生理代謝；高糖

富馬酸是一種重要的C4二羧酸，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、樹脂合成等領(lǐng)域，隨著全球石油資源的不斷消耗和枯竭，發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸愈來愈受到人們的廣泛關(guān)注［1-2］。米根霉被認(rèn)為是富馬酸的最優(yōu)生產(chǎn)菌株之一［3］，但在批次發(fā)酵中，產(chǎn)物富馬酸的質(zhì)量濃度較低，僅為30g/L左右，增加了后續(xù)分離成本，削弱了生物基富馬酸與石油基產(chǎn)品的競爭優(yōu)勢。

高糖發(fā)酵具有產(chǎn)物單位濃度高、設(shè)備利用率高、提取工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)發(fā)酵中被廣泛應(yīng)用。目前，工業(yè)上高糖發(fā)酵往往采用流加補(bǔ)料的方式實(shí)現(xiàn)，但這種方式存在底物利用率低、染菌概率大、需要增加額外能耗及設(shè)備投資等問題［4-6］，主要是自然微生物不能耐受高濃度的底物。針對(duì)這一問題，研究者多采用菌種誘變選育、高糖馴化等方式對(duì)菌株進(jìn)行改造，以期提高其糖耐受性。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員在前期研究過程中，亦通過高糖馴化的方法獲得了具有較高葡萄糖耐受能力的富馬酸發(fā)酵菌株。本文中，筆者擬以前期獲得的耐高糖菌株及原始菌株（不耐受高葡萄糖濃度）為研究對(duì)象，對(duì)2株菌生理代謝差異進(jìn)行比較，發(fā)掘影響菌株糖耐受性的關(guān)鍵生理因子，揭示微生物在高糖脅迫下的應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制，以期為進(jìn)一步提高米根霉高糖發(fā)酵水平奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

耐高糖米根霉（Rhizopus oryzae H15），為Rhizopus oryzae ME-F14的突變株，保藏于南京工業(yè)大學(xué)代謝工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面培養(yǎng)基（g/L）：去皮馬鈴薯200、蔗糖20、瓊脂20。pH自然。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30、尿素20、KH2PO40.6、MgSO4·7H2O 0.11、FeSO4·7H2O40.008 8；pH 2.5。培養(yǎng)條件為250mL搖瓶裝液量50mL，35℃、200r/min，培養(yǎng)30 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖80、120、150，尿素0.2，CaCO3為中和劑；pH自然。其他成分與預(yù)培養(yǎng)基相同。培養(yǎng)條件為250mL搖瓶裝液量40mL，以體積分?jǐn)?shù)10%接入種子液，于35℃、200r/min培養(yǎng)3～4 d。

1.2 分析方法

1.2.1 生物量的測定

菌體抽濾，無菌水洗滌，抽干，60℃烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，取平均值［7］。

1.2.2 葡萄糖濃度的測定

參照文獻(xiàn)［8］使用SBA-40C型生物傳感分析儀測定葡萄糖濃度。

1.2.3 富馬酸產(chǎn)量的測定

由戴安P680型高效液相色譜檢測［8］。具體條件：Chromeleon工作站，Sepax HP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為0.1%磷酸-乙腈溶液（體積比為96.5∶3.5），流速0.6mL/min，柱溫25℃，紫外檢測波長210nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.4 細(xì)胞膜脂肪酸的測定

細(xì)胞膜脂肪酸樣品的制備按照文獻(xiàn)［9］的方法進(jìn)行。氣相色譜分析條件：Thermo finnigan GC2000 DSQ型氣相色譜儀，色譜柱DB-5MS（30 mm×0.32 mm，0.25μm）；載氣 He，載氣流量 1mL/min。升溫程序：初始溫度80℃，以40℃/min速率升溫，升到200℃，然后繼續(xù)以10℃/min速率升溫到300℃。傳輸線溫度250℃，電離方式EI，70 eV，掃描范圍50～600 aum。接口溫度250℃，進(jìn)樣溫度250℃。

1.2.5 三磷酸腺苷（ATP）含量的測定

胞內(nèi)樣品的制備根據(jù)文獻(xiàn)［10］的方法進(jìn)行改進(jìn)。取菌體1mL于-40℃甲醇中猝滅 5min，-8℃ 5 000g離心5min，加入1mL 50%高氯酸冰浴10min，滴加一定量的K2CO3中和，5 000g離心10min。上清液用于檢測ATP。高效液相色譜檢測，戴安 P680，Chromeleon工作站，Sepax HPC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（10.93g NaH2PO4和 3.04g Na2HPO4溶于純水中，加入四丁基溴化銨3.22g，調(diào)節(jié)pH為6.5，真空抽濾定容至1 L）和乙腈（體積比為86∶4）；流速1mL/min；檢測波長254nm；柱溫35℃。

1.2.6 滲透壓的測定

發(fā)酵液滲透壓采用OSMOMAT030冰點(diǎn)滲透壓儀測定［11］。

1.2.7 側(cè)系呼吸強(qiáng)度測定

發(fā)酵36 h，采用液相氧電極 Chlorolab-3測定［12］。測定呼吸速率1～2min后，取30g/L的水楊氧肟酸（SHAM）30 μL，繼續(xù)測定1～2min，記錄加入菌體初始的呼吸速率R1及加入SHAM之后的呼吸速率R2，側(cè)系呼吸強(qiáng)度由式（1）計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 高低糖條件下菌株發(fā)酵特性的比較

分別將耐高糖菌株及原始菌株接入葡萄糖質(zhì)量濃度為80、120和150g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，考察其生長情況，結(jié)果見圖1。由圖1可知：在低糖濃度下，2株菌的發(fā)酵差異不明顯。發(fā)酵60 h時(shí)，富馬酸產(chǎn)量約為29g/L。但隨著糖濃度的增加，2株菌差異逐漸顯現(xiàn)。當(dāng)糖質(zhì)量濃度為120g/L時(shí)，耐高糖菌株的整體發(fā)酵時(shí)間為84 h，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，富馬酸產(chǎn)量達(dá)37.7g/L，而原始菌株發(fā)酵120 h后葡萄糖才被完全消耗，富馬酸產(chǎn)量為31.03g/L。當(dāng)糖質(zhì)量濃度增至150g/L時(shí)，發(fā)酵108 h，耐高糖菌株富馬酸產(chǎn)量達(dá)41.6g/L，而此時(shí)原始菌株富馬酸產(chǎn)量僅為35.36g/L。表明在高糖濃度下，經(jīng)多次傳代馴化后的富馬酸生產(chǎn)菌細(xì)胞代謝可能發(fā)生了變化，從而能夠耐受外界較高的糖濃度。

2.2 菌株耐高糖生理特性的研究

2.2.1 高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸組分的影響

細(xì)胞膜是菌體應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的第一道屏障，決定了糖是否能夠順利進(jìn)入細(xì)胞，參與代謝。在對(duì)耐高糖菌株生理代謝的研究中，考察高糖脅迫條件下原始菌株與耐高糖菌株細(xì)胞膜組分的變化，結(jié)果見表1。由表1可知：隨著糖濃度的增加，2株菌總不飽和脂肪酸（TUFA）含量及不飽和與飽和脂肪酸的質(zhì)量比例（U/S）均逐漸上升，而總飽和脂肪酸（TSFA）則逐漸下降，且存在明顯差異。當(dāng)糖質(zhì)量濃度為80g/L時(shí)，耐高糖菌株中TUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60.54%，較原始菌株（48.76%）高11.78%，而U/S較原始菌株高61%；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度高達(dá)150g/L時(shí)，耐高糖菌株與原始菌株細(xì)胞膜脂肪酸組分的差異愈加明顯，耐高糖菌株中TUFA比原始菌株質(zhì)量分?jǐn)?shù)高出17.29%，U/S比例較原始菌株提高了108%。上述結(jié)果表明，在響應(yīng)外界高糖環(huán)境時(shí)，菌株細(xì)胞膜的脂肪酸組分發(fā)生改變，不飽和脂肪酸組分增多，增加細(xì)胞的流動(dòng)性，促進(jìn)底物進(jìn)入細(xì)胞，更好地適應(yīng)外界環(huán)境。

圖1 不同初糖濃度條件下原始菌株與耐高糖菌株富馬酸發(fā)酵曲線Fig.1 Time course of fumaric acid production by parent strain and high-glucose resistant strain under different glucose concentrations

表1 不同糖濃度條件下，原始菌株與耐高糖菌株細(xì)胞膜脂肪酸成分的變化Table 1 Changes in membrane fatty acids composition of parent strain and high-glucose resistant strain under different glucose concentrations

2.2.2 高糖環(huán)境對(duì)胞內(nèi)ATP含量的影響

ATP是胞內(nèi)的能量貨幣，是細(xì)胞代謝的重要參與者?？疾炝嗽诓煌孜餄舛认拢季昱c耐高糖菌株胞內(nèi)ATP的變化，結(jié)果見表2。由表2可知：在同一糖濃度下，耐高糖菌ATP含量明顯高于原始菌株，且隨著糖濃度的增加，2株菌胞內(nèi)ATP含量差異逐漸增大，在80g/L葡萄糖條件下，原始菌胞內(nèi)ATP含量為0.37 nmol/mg，耐高糖菌為0.41 nmol/mg；當(dāng)糖質(zhì)量濃度增加到150g/L時(shí)，原始菌胞內(nèi)ATP為0.44 nmol/mg，耐高糖菌為0.76 nmol/mg。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是隨著糖濃度的增加，糖酵解和三羧酸循環(huán)（TCA）等途徑調(diào)控作用顯現(xiàn)，并伴隨著胞內(nèi)ATP再生速度的顯著加快［13］。而耐高糖菌株胞內(nèi)較高的ATP為細(xì)胞在高糖環(huán)境下提供了更多的代謝動(dòng)力，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外界不良環(huán)境的抵御。

表2 不同糖濃度條件下原始菌株與耐高糖菌株的胞內(nèi)ATP濃度Table 2 Changes in the intracellular ATP concentration levels of parent strain and high-glucose resistant strain under different glucose concentrations

2.2.3 高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞呼吸特性的影響

考察高糖濃度對(duì)發(fā)酵液的滲透壓，結(jié)果見表3。由表3可知：當(dāng)糖質(zhì)量濃度由80g/L增至150g/L時(shí)，發(fā)酵液的滲透壓由1.36 kPa增至2.44 kPa。高滲環(huán)境可能會(huì)引起胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的變化，從而使細(xì)胞遭受毒害，減少ROS的產(chǎn)生，成為提高菌體抵御高滲環(huán)境的關(guān)鍵。電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅲ是ROS的主要產(chǎn)生位點(diǎn)，產(chǎn)生20%～80%的超氧陰離子·，而本課題組Gu等［14］在前期研究中發(fā)現(xiàn)，米根霉產(chǎn)富馬酸的過程中除了電子傳遞鏈還存在著1條側(cè)系呼吸途徑，該途徑能夠繞過復(fù)合物Ⅲ和Ⅳ，由交替氧化酶（AOX）直接將泛醌的電子交給終端受體O2（圖2），有助于降低胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而有望增強(qiáng)菌株的抗脅迫能力?；谶@一認(rèn)識(shí)，筆者對(duì)原始菌株及耐高糖菌株在不同糖濃度下的側(cè)系呼吸強(qiáng)度進(jìn)行了測定，結(jié)果見表4。由表4可知：隨著糖濃度的增加，細(xì)胞側(cè)系呼吸強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。而在同一糖濃度下，耐高糖菌株的側(cè)系呼吸強(qiáng)度明顯高于原始菌株，當(dāng)糖質(zhì)量濃度達(dá)150g/L時(shí)，耐高糖菌株的側(cè)系呼吸強(qiáng)度為46.7%，而原始菌株僅為38.5%。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了側(cè)系呼吸途徑在減少ROS產(chǎn)生中的重要作用。

表3 不同糖濃度條件下發(fā)酵液滲透壓的變化Table 3 Changes in osmolality under different glucose concentrations

圖2 標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈和側(cè)系呼吸鏈酶系［14］Fig.2 Enzymes of CN-sensitivity and SHAM-sensitivity respiration［14］

表4 不同糖濃度條件下原始菌株與耐高糖菌株側(cè)系呼吸強(qiáng)度的變化Table 4 Changes in SHAM-sensitivity respiration of parent strain and high-glucose resistant strain under different glucose concentrations

2.3 外源添加對(duì)米根霉高糖發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的影響

菌種選育是目前提高菌株糖耐受性的主要方法，但菌種選育的隨機(jī)性較大，且存在傳代多次后退化的潛在風(fēng)險(xiǎn)。若能夠通過簡單的發(fā)酵工藝調(diào)控，即能增強(qiáng)菌株對(duì)高糖的耐受性，將極大地簡化工藝，提高效率。筆者擬基于上述對(duì)菌株耐高糖機(jī)制的解析，探討利用外源添加的方法補(bǔ)充原始菌株在生理代謝上的不足，以期提高菌株糖耐受能力。

2.3.1 調(diào)節(jié)C/N，提高米根霉產(chǎn)富馬酸過程的糖耐受性

高氮含量能夠激活TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶檸檬酸合酶，從而有望合成更多的ATP，供菌體抵御外界環(huán)境脅迫。以原始菌株為研究對(duì)象，分別考察不同C/N條件下，米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的性能，結(jié)果見圖3。由圖3可知：隨著C/N的升高，菌株的耗糖速率逐漸加快，C/N為500條件下，富馬酸的發(fā)酵時(shí)間比C/N為1 500時(shí)縮短了12 h，同時(shí)富馬酸產(chǎn)量由37.4g/L增加至40.2g/L。表明通過C/N的調(diào)節(jié)能夠有效增強(qiáng)菌株的高糖耐受性。

圖3 高糖條件下不同C/N對(duì)富馬酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of C/N ratios on fumaric acid production under high-glucose concentration

2.3.2 添加甘氨酸，提高米根霉糖耐受性

氨基酸代謝與胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，能夠增強(qiáng)己糖路徑（EMP）與三羧酸循環(huán)（TCA），從而提高細(xì)胞代謝活力，增加細(xì)胞抵御不良環(huán)境的能力。而甘氨酸（Gly）可以在微生物胞內(nèi)積累到較高濃度而對(duì)胞內(nèi)其他微生物生理過程沒有明顯的負(fù)面影響。因此，筆者嘗試在高糖發(fā)酵初期添加甘氨酸，考察甘氨酸對(duì)富馬酸發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：以未添加甘氨酸的為對(duì)照，加入0.5g/L甘氨酸的菌株糖耗及產(chǎn)酸速率得到提高，發(fā)酵周期縮短24 h，富馬酸產(chǎn)量由37.4g/L增加至43.8g/L。表明甘氨酸能夠促進(jìn)細(xì)胞能力代謝，提高細(xì)胞抵御高糖壓力的能力。

圖4 高糖條件下添加甘氨酸對(duì)富馬酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of addition of glycine on fumaric acid production under high-glucose concentration

3 結(jié)論

通過比較原始菌株與耐高糖菌株的代謝差異，發(fā)現(xiàn)耐高糖菌株細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量較高，胞內(nèi)ATP含量增加，抵御ROS的側(cè)系呼吸途徑增強(qiáng)，表明耐高糖菌株具有更好的流動(dòng)性、更大的細(xì)胞代謝動(dòng)力以及抵御高滲環(huán)境的能力，從而使得細(xì)胞在高糖條件下具有較優(yōu)的發(fā)酵性能?；谶@一發(fā)現(xiàn)，在高糖質(zhì)量濃度（150g/L）下，通過調(diào)節(jié)C/N或添加甘氨酸以彌補(bǔ)細(xì)胞的能量不足。當(dāng)C/N為500時(shí)，原始菌株發(fā)酵周期可縮短12 h，富馬酸產(chǎn)量由37.4g/L增加至40.2g/L，當(dāng)添加0.5g/L甘氨酸時(shí)，原始菌株發(fā)酵周期可縮短24 h，富馬酸產(chǎn)量由37.4g/L增加至43.8g/L。表明通過外源添加的方法可以提高細(xì)胞的代謝動(dòng)力，緩解高糖脅迫。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Physiological characteristics of a high-glucose resistant Rhizopus oryzae

LYU Chunwei，XU Qing，CHEN Jiao，LI Shuang
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 210009，China）

Fermentation in high glucose is a common strategy to improve the product concentration in industry.However，natural strains can not withstand high glucose.With the aim of elucidating the effects of high glucose on physiological metabolism of fumaric acid producer Rhizopus oryzae，membrane fatty acid composition，intracellular adenosine triphosphate（ATP）level，and the salicylhy-droxamic acid sensitivity respiration of the parent strain and the high-glucose resistant strain were determined and compared at different glucose concentrations.Compared to that of the parent strain，the high-glucose resistant strain exhibited higher content of the unsaturated fatty acids and higher membrane fluidity，higher ATP level and stronger salicylhy-droxmic acid sensitivity respiration.To compensate the deficiencies in metabolic of the parent strain，C/N ratio was adjusted or glycine was added.In fermentation with 150g/L glucose medium，and 500 C/N，fumaric acid could increase from 37.4 to 40.2g/L.The addition of 0.5g/L glycine also improved the productivity of fumaric acid by 17.1%，it increased to 43.8g/L.

Rhizopus oryzae；fumaric acid；physiological metabolism；high glucose

Q939.97

A

1672-3678（2015）03-0036-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.007

2014-01-12

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2013CB733600）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2011AA02A206）；國家自然科學(xué)基金（21106065）

呂春微（1988—），女，江蘇新沂人，碩士研究生，研究方向：微生物細(xì)胞生理；李 霜（聯(lián)系人），教授，E-mail：lishuang@njtech.edu.cn