利用產(chǎn)脂肪酶B的畢赤酵母工程菌生物拆分制備西司他丁關(guān)鍵手性中間體的體系優(yōu)化

鄭 磊，何軍邀，2，黃 金，王 普

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100）

利用產(chǎn)脂肪酶B的畢赤酵母工程菌生物拆分制備西司他丁關(guān)鍵手性中間體的體系優(yōu)化

鄭 磊1，何軍邀1，2，黃 金1，王 普1

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江 寧波 315100）

S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸（S-（+）-DMCPA）是合成西司他丁的關(guān)鍵手性中間體。構(gòu)建的畢赤酵母工程菌生產(chǎn)的脂肪酶可高選擇性催化外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯（DMCPE）不對稱水解制備S-（+）-DMCPA。對該工程菌產(chǎn)胞外脂肪酶的產(chǎn)酶條件及生物拆分反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高其催化效率。優(yōu)化獲得重組畢赤酵母最佳產(chǎn)酶條件：采用BMMY培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始pH 8.0，500mL搖瓶裝50mL培養(yǎng)基，每隔4 h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加終體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇。培養(yǎng)192 h后，發(fā)酵液中脂肪酶比酶活為4.41 U/L，較優(yōu)化前提高了90.9%。利用含脂肪酶的發(fā)酵上清液進(jìn)行DMCPE的生物拆分反應(yīng)，底物濃度為15mmol/L，30℃反應(yīng)36 h，S-（+）-DMCPA的產(chǎn)率可達(dá)43.8%，e.e.值為99.8%。

西司他?。划叧嘟湍?；脂肪酶；S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸；生物拆分

西司他丁是第一個應(yīng)用于臨床的腎脫氫二肽酶抑制劑，S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸（S-（+）-DMCPA）是合成西司他丁的關(guān)鍵手性中間體［1-2］。目前，西司他丁手性中間體主要通過化學(xué)法合成，但存在污染大、合成條件苛刻等缺點(diǎn)［3-4］。由于生物催化法具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高和環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用于藥物手性中間體的合成已逐漸成為研究熱點(diǎn)［1］。Wang等［5］從土壤中篩選得到可不對稱水解2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈制備S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的菌株Rhodococcus sp.AJ270，產(chǎn)率達(dá)44%，e.e.值為88%。Yeom等［6］利用Rhodococcus erythropolis不對稱水解外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈合成S-（+）-DMCPA，產(chǎn)率為45%，e.e.值為81.8%。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員前期采用脂肪酶435催化2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯（DMCPE）不對稱水解合成西司他丁關(guān)鍵手性中間體S-（+）-DMCPA［7］，當(dāng)脂肪酶435用量為16g/L、底物DMCPE濃度為65mmol/L時，以pH 7.2的1mol/L H3PO4緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，30℃反應(yīng)64 h，產(chǎn)物的產(chǎn)率和e.e.值分別為45.6%和99.2%。但由于商品脂肪酶價格較高，成為限制其工業(yè)化應(yīng)用的重要因素之一［8］，利用微生物產(chǎn)脂肪酶替代商品脂肪酶將成為降低工業(yè)化應(yīng)用成本的途徑之一。

脂肪酶廣泛存在于動植物和微生物中，由于微生物具有種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳突變等特點(diǎn)，目前微生物源脂肪酶已成為研究熱點(diǎn)。酵母菌是國內(nèi)外研究最多的微生物之一，且大部分酵母的發(fā)酵產(chǎn)物被認(rèn)為對人體安全無害，因而酵母菌成為脂肪酶的重要來源之一，如來源于皺褶假絲酵母（Candida rugosa）和南極假絲酵母（Candida antarctica）的脂肪酶［9］。脂肪酶B是從南極假絲酵母中分離得到的一種具有高效專一性的脂肪酶［10］，目前已被克隆表達(dá)于多種宿 主，如 Aspergillus oryzae［11］、Pichia pastoris［12］、Saccharomyces cerevisiae［13］、Escherichia coli［14］和Yarrowia lipolytica［15］。 Liu 等［16］將 C.antarctica ZJB09193中的脂肪酶基因在P.pastoris X33中成功表達(dá)，并利用該脂肪酶催化合成維生素A酯。利用基因工程菌表達(dá)外源蛋白催化合成藥物手性中間體將成為醫(yī)藥工業(yè)的研究新方向。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員以Pichia pastoris為宿主菌株，以pPICZaA為表達(dá)載體，采用PCR裝配法，成功克隆表達(dá)了脂肪酶B基因，利用該重組菌產(chǎn)生的胞外脂肪酶可高選擇性催化外消旋DMCPE不對稱水解制備得到西司他丁關(guān)鍵手性中間體S-（+）-DMCPA。本研究中，筆者通過對該菌株的最佳產(chǎn)酶條件和生物拆分條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高該菌株所產(chǎn)脂肪酶的催化效率，進(jìn)而為后續(xù)的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

含脂肪酶B基因的畢赤酵母（Pichia pastoris）菌株（表達(dá)載體pPICZaA），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員自行構(gòu)建、保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

酵母粉-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸出粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂粉15。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

甘油基礎(chǔ)緩沖培養(yǎng)基（BMGY）（1 L）：無氨基酵母氮源（YNB）13.4g，500×生物素2mL，甘油10g，酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，1mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液100mL。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

甲醇基礎(chǔ)緩沖培養(yǎng)基（BMMY）（1 L）：YNB 13.4g，500×生物素2mL，無水甲醇10mL，酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，1mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液100mL。

1.3 培養(yǎng)條件

將保藏菌種劃線轉(zhuǎn)接至YPD培養(yǎng)基上活化，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，將單菌落接種至50mL BMGY培養(yǎng)基，200r/min、30℃振蕩培養(yǎng)至600nm的吸光度值OD600為2～6。

以10%的接種量將種子液接入裝有50mL BMMY培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，200r/min、30℃下，每24 h按培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)的1%補(bǔ)加無水甲醇，培養(yǎng)96 h后檢測發(fā)酵液中胞外脂肪酶的酶活。

1.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

為了考察畢赤酵母工程菌的最佳產(chǎn)酶條件，分別對裝液量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、補(bǔ)加甲醇濃度、甲醇添加時間間隔和產(chǎn)酶發(fā)酵時間進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每項(xiàng)優(yōu)化結(jié)果都用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 生物拆分DMCPE制備S-（+）-DMCPA的反應(yīng)條件優(yōu)化

為了考察重組菌株所產(chǎn)脂肪酶不對稱拆分DMCPE制備S-（+）DMCPA的最佳反應(yīng)條件，采用最佳產(chǎn)酶條件下培養(yǎng)得到的含酶發(fā)酵液，分別選取不同反應(yīng)溫度（25～45℃）、底物濃度（10～30mmol/L）和反應(yīng)時間進(jìn)行生物拆分反應(yīng)，氣相色譜法（GC）檢測得到S-（+）-DMCPA產(chǎn)率和e.e.值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每項(xiàng)優(yōu)化結(jié)果都用于以后的實(shí)驗(yàn)。

1.6 檢測方法與酶活力定義

底物DMCPE和產(chǎn)物S-（+）-DMCPA的濃度和e.e.值采用氣相色譜法檢測，具體測定條件參照文獻(xiàn)［16］。

酶活力定義：在30℃下，1min內(nèi)不對稱水解DMCPE生成1 μmol S-（+）-DMCPA所需的酶量，定義為1個酶活單位（U）。

酶活力檢測方法：取10mL發(fā)酵上清液于50mL錐形瓶中，加入0.02g底物DMCPE，30℃、200r/min反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入2倍體積的乙酸乙酯，30℃、200r/min振蕩萃取45min，靜置分層后取乙酸乙酯相檢測產(chǎn)物S-（+）-DMCPA的生成量，計(jì)算得到單位體積發(fā)酵液的脂肪酶酶活（U/L）。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.1.1 裝液量對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵產(chǎn)酶時，培養(yǎng)基裝液量會影響搖瓶內(nèi)的溶氧水平，進(jìn)而影響菌體生長和目的蛋白的表達(dá)。為了考察裝液量對產(chǎn)酶的影響，將種子液接至不同裝液量（25、50、75、100和150mL BMMY培養(yǎng)基）的500mL三角瓶中，按發(fā)酵培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)96 h后檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知：當(dāng)裝液量為50mL時，比酶活達(dá)到最大值（2.31 U/L），繼續(xù)增加裝液量，酶活逐漸下降。原因可能是裝液量過少會增加發(fā)酵過程中發(fā)酵液的蒸發(fā)損失，使有害代謝物濃度上升，從而影響菌體的生長及脂肪酶的表達(dá)。適量增加裝液量可部分緩解上述問題，但裝液量過多會導(dǎo)致培養(yǎng)基中溶氧水平降低，影響菌體生長和蛋白表達(dá)。因此，最佳裝液量為500mL三角瓶中裝液50mL。

圖1 裝液量對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of loaded volume on enzyme activity

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響

重組畢赤酵母可在pH 3.0～7.0范圍內(nèi)正常生長，但外源蛋白表達(dá)的適宜pH隨著目的蛋白不同存在很大的差異?？疾彀l(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響，將種子液接入初始 pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的BMMY培養(yǎng)基中，按發(fā)酵液培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，96 h后檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，結(jié)果如圖2所示。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of pH on enzyme activity

由圖2可知：培養(yǎng)基初始pH為8.0時比酶活最高（3.0 U/L）。當(dāng)pH低于8.0時，脂肪酶酶活隨pH升高明顯增加，這可能是由于發(fā)酵過程中菌體產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物使發(fā)酵液酸性增強(qiáng)，從而影響細(xì)胞代謝和脂肪酶酶活。當(dāng)pH高于8.0時，堿性條件會抑制畢赤酵母的生長，從而抑制脂肪酶的表達(dá)。故培養(yǎng)基初始pH以8.0為宜。

2.1.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)階段，甲醇可作為重組畢赤酵母的C源和產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)醇氧化酶（AOX）的合成［17］，因此，甲醇體積分?jǐn)?shù)可能會影響胞外蛋白的表達(dá)量。按發(fā)酵液培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h按培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)的0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%和2.0%補(bǔ)加無水甲醇，培養(yǎng)96 h后檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，結(jié)果如圖3所示。

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of methanol volume fraction on enzyme activity

由圖3可知：當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%時，已有胞外脂肪酶的表達(dá)，但酶活較低，表明0.5%的甲醇不能有效維持重組畢赤酵母的菌體生長代謝及胞外蛋白表達(dá)。隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，脂肪酶活力逐漸提高；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%時，脂肪酶比酶活力最高（3.32 U/L）；繼續(xù)提高甲醇體積分?jǐn)?shù)，脂肪酶比酶活力下降迅速，原因可能是甲醇積累抑制了細(xì)胞生長［18］。因此選擇甲醇的最佳誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為1.0%。

2.1.4 甲醇添加時間間隔對產(chǎn)酶的影響

畢赤酵母含有2個AOX基因，分別為AOX1和AOX2，其中AOX1為強(qiáng)啟動子，細(xì)胞中絕大多數(shù)醇氧化酶活力由 AOX1提供［19］。將種子液接入BMMY培養(yǎng)基中，按發(fā)酵液培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔4、8、12和24 h補(bǔ)加甲醇1次，培養(yǎng)96 h后檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，結(jié)果如圖4所示。

圖4 甲醇添加時間間隔對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of time interval of adding methanol on enzyme activity

由圖4可知：在24 h內(nèi)甲醇添加總量不變的情況下，甲醇添加時間間隔為4 h時比酶活最高（4.06 U/L），隨著添加時間間隔的變大，酶活逐漸下降。這主要是由于重組畢赤酵母對甲醇濃度的瞬間變化較敏感，甲醇濃度頻繁波動會導(dǎo)致AOX1活力降低，并可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此維持發(fā)酵液中甲醇濃度相對穩(wěn)定對提高重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)有重要意義［20-21］。

2.1.5 培養(yǎng)時間對酶活的影響

按發(fā)酵液培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h取樣檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，分別培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168、192和216 h，考察培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of fermentation time on enzyme activity

由圖5可知：隨著發(fā)酵時間的延長，脂肪酶活力逐漸提高，在192 h時比酶活最高（4.41 U/L），比優(yōu)化前（2.31 U/L）提高90.9%。192 h后有所下降，推測為菌體密度大、營養(yǎng)缺乏、酵母細(xì)胞衰老、表達(dá)外源蛋白能力減弱，酵母細(xì)胞分泌的蛋白酶積累，降解外源蛋白，從而導(dǎo)致酶活下降［22］。因此，確定最佳發(fā)酵時間為192 h。據(jù)文獻(xiàn)［2］報道，脂肪酶435比酶活為0.92 U/g，因此，每升該發(fā)酵液酶活力相當(dāng)于4.79g脂肪酶435酶活力。

2.2 生物拆分制備S-（+）-DMCPA的條件優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)溫度對拆分產(chǎn)率和e.e.值的影響

反應(yīng)溫度在手性拆分過程中對酶活力以及對映體選擇性具有關(guān)鍵作用?？疾觳煌瑴囟龋?5、30、35、40和45℃）對產(chǎn)物S-（+）-DMCPA產(chǎn)率和e.e.值的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知：當(dāng)溫度為30℃時，S-（+）-DMCPA產(chǎn)率最高。隨著溫度升高，產(chǎn)率逐漸下降，這可能是由于高溫導(dǎo)致脂肪酶失活。而e.e.值隨溫度變化不大，均在99%以上。因此最佳反應(yīng)溫度為30℃。

圖6 溫度對拆分產(chǎn)率和e.e.值的影響Fig.6 Effects of temperature on yield and e.e.value of S-（+）-DMCPA

2.2.2 底物濃度對產(chǎn)率和e.e.值的影響

底物濃度越高，酶與底物接觸的幾率就越高，反應(yīng)也越充分；當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，酶催化反應(yīng)速度與底物濃度成正比，反應(yīng)速度隨著底物濃度的增加而加快。當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^一定值后，反應(yīng)速度的上升與底物濃度不再成正比，而是逐漸趨向平衡，此時繼續(xù)增大底物濃度已無意義。為此，考察不同底物濃度（10、15、20、25和30mmol/L）對產(chǎn)物S-（+）-DMCPA產(chǎn)率和 e.e.值的影響，結(jié)果如圖 7所示。

圖7 底物濃度對拆分產(chǎn)率和e.e.值的影響Fig.7 Effects of substrate concentration on yield and e.e.value of S-（+）-DMCPA

由圖7可知：當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?5mmol/L時，S-（+）-DMCPA產(chǎn)率均保持在40%以上，e.e.值為99%以上。繼續(xù)增加底物濃度，產(chǎn)率降低，綜合考慮產(chǎn)率和e.e.值，選擇最適底物濃度為15mmol/L。底物濃度高于 Wang等［5］報道的利用 Rhodococcus sp.AJ270不對稱水解1mmol/L的2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈制備S-（+）-DMCPA，產(chǎn)物e.e.值也優(yōu)于其報道的88%。

2.2.3 反應(yīng)時間對產(chǎn)率和e.e.值的影響

為考察反應(yīng)時間對產(chǎn)率和e.e.值的影響，反應(yīng)8 h后每隔4 h取樣檢測，考察產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e.值隨時間的變化規(guī)律，結(jié)果如圖8所示。

圖8 反應(yīng)時間對產(chǎn)率和e.e.值的影響Fig.8 Effects of time course on yield and e.e.value of S-（+）-DMCPE

由圖8可知：S-（+）-DMCPA產(chǎn)率隨著時間的延長而增高，e.e.值均在99%以上，36 h時產(chǎn)率最大，為43.8%，產(chǎn)物濃度達(dá)6.6mmol/L。繼續(xù)延長反應(yīng)時間未能提高產(chǎn)率，綜合考慮產(chǎn)率和e.e.值，選擇反應(yīng)時間為36 h。

3 結(jié)論

利用工程菌產(chǎn)生的胞外脂肪酶催化外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對稱水解合成西司他丁關(guān)鍵手性中間體S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸。當(dāng)500mL三角瓶裝液量為50mL，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為8.0，產(chǎn)酶培養(yǎng)過程中每隔4 h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加終體積分?jǐn)?shù)為1.0%的甲醇，200r/min、30℃下誘導(dǎo)發(fā)酵192 h，酶活可達(dá)到4.41 U/L，較優(yōu)化前（2.31 U/L）提高90.9%。優(yōu)化獲得最佳轉(zhuǎn)化條件：200r/min、30℃、底物濃度15mmol/L、反應(yīng)36 h，產(chǎn)物S-（+）-DMCPA產(chǎn)率為43.8%，e.e.值為99.8%。

采用重組脂肪酶催化DMCPE不對稱水解合成西司他丁關(guān)鍵手性中間體S-（+）-DMCPA，與采用產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的全細(xì)胞催化相比，以含胞外脂肪酶的發(fā)酵上清液直接催化具有預(yù)處理簡單、反應(yīng)過程中傳質(zhì)阻力小等優(yōu)點(diǎn)；與脂肪酶435的催化相比，具有成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。但目前工藝仍然存在菌體產(chǎn)酶周期較長、催化水解的底物濃度較低等缺點(diǎn)，如何縮短菌體培養(yǎng)時間、提高底物濃度及脂肪酶重復(fù)利用將會成為后續(xù)的研究方向。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Process optimization catalyzed by recombinant Pichia patoris derived lipase B for the synthesis of cilastatin

ZHENG Lei1，HE Junyao1，2，HUANG Jin1，WANG Pu1
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China）

S-（+）-2，2-dimethylcyclopropane carboxylic acid （S-（+）-DMCPA） is a key chiral intermediate for the synthesis of cilastatin.A recombinant Pichia patoris can convert racemic ethyl-2，2-dimethylcyclopropane carboxylate（DMCPE）to S-（+）-DMCPA with high enantioselectivity.In order to enhance its catalytic efficiency，the lipase-producing conditions and catalytic conditions were optimized. The optimal conditions for lipase production were as follows：the optimal loaded volume was 50mL/500mL，initial pH of fermentation medium was 8.0.Methanol was added into the medium to a final concentration of 1%（V/V）at every 4 h intervals.Under the optimal conditions，the lipase activity of the recombinant reached 4.41 U/L within 192 h，with an increase of 90.9%compared to the control.The supernatant containing lipase was then used for biocatalytic resolution of DMCPE to S-（+）-DMCPA at 15mmol/L substrate concentration at 30℃ for 36 h.Under above conditions，the best yield of 43.8%was obtained with enantiomeric excess（e.e.）value of 99.8%.

cilastatin；Pichia pastoris；lipase；S-（+）-2，2-dimethylcyclopropane carboxylic acid；biocatalytic resolution

Q815

A

1672-3678（2015）03-0070-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.013

2014-03-26

浙江省科技廳重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（2010C11040）；浙江省級公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃（2011C33005）；浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201226056）

鄭 磊（1989—），男，浙江杭州人，碩士研究生，研究方向：生物催化與手性合成；王 普（聯(lián)系人），教授，E-mail：wangpu@zjut.edu.cn