通過DNA改組技術定向進化賴氨酸脫羧酶基因cadA和ldc

張 凱，蔡 恒，汪 晨

（南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800）

通過DNA改組技術定向進化賴氨酸脫羧酶基因cadA和ldc

張 凱，蔡 恒，汪 晨

（南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800）

利用DNA改組技術對賴氨酸脫羧酶野生型基因ldc進行隨機突變，在大腸桿菌Escherichia coli JM109中構建賴氨酸脫羧酶突變體庫。從E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分別克隆出賴氨酸脫羧酶基因cadA和ldc。查詢NCBI數(shù)據(jù)庫得知，二者的同源性為75%。分別構建重組質粒pTrc99a-cadA和pTrc99a-ldc，以此2種質粒為模板，經PCR擴增，獲得目的基因片段，分析目的基因片段中存在的限制性酶切位點，用多種限制性內切酶碎片化2種基因，切割成不同大小的片段。這些小片段進行不同組合，突變體經過LBXL平板初篩和高效液相色譜（HPLC）復篩，獲得1株酶活性提高的賴氨酸脫羧酶突變體，編號為LDC2-16，其比酶活為4 869.86 U/mg（以1 mg總蛋白計），與2種野生型賴氨酸脫羧酶基因表達的酶CadA（1 652.63 U/mg）、Ldc（2 365.93 U/mg）相比，在最適溫度37℃、pH 6.0時，突變體的比酶活分別是上述野生型酶的2.95和2.06倍。搖瓶發(fā)酵5 h后，目標產物1，5-戊二胺產量從46.9提高至63.9 g/L，提高了36%。

DNA改組；定向進化；賴氨酸脫羧酶；蜂房哈夫尼菌；大腸桿菌

賴氨酸脫羧酶（L-lysine decarboxylase，Ldc，EC 4.1.1.18）是生物體內可逆地催化L-賴氨酸脫羧生成1，5-戊二胺和CO2的高度專一性酶［1］。1，5-戊二胺在農業(yè)、醫(yī)學、化學工業(yè)等領域有著廣泛的應用。作為一種重要的化工原料，1，5-戊二胺是由可再生原料衍生得到的生物聚酰胺，可以替代傳統(tǒng)化工方法生產的生物胺——己二胺［2］，能應用于各種聚酰胺產品、聚氨酯、螯合劑和添加劑等，與二元酸進行聚合反應可合成優(yōu)質高分子材料——新型尼龍［3］。它是一種環(huán)保型的、可持續(xù)發(fā)展型的、耐高溫的生物塑料，有著廣泛的應用前景［4］。

Ldc存在于 E.coli、尸胺桿菌 （Bacterium cadaveris）和蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）等微生物中，同時也存在于高等植物中，如黃瓜等。該酶是誘導性胞內酶，需要磷酸吡哆醛作為輔酶促進脫羧反應［5］。

酶的體外定向進化，不需要提前對酶的空間結構以及催化機制進行詳細地了解和掌握，只需要通過人為改變基因突變過程中的反應條件，模擬自然進化過程（隨機突變、重組和自然選擇），在體外進行基因突變、基因重組等操作，進行基因突變體庫的構建，根據(jù)不同基因的特性來建立高通量篩選方法，最終獲得理想的突變酶［6］。DNA改組（DNA shuffling），又稱有性PCR［7-8］，該方法是將親本基因進行盡可能多的組合，最終獲得理想突變體。不管是從理論角度，還是從實踐角度，該方法都比重復寡核苷酸引導進行的誘變及易錯PCR的方法等更有利于獲得有意義突變，其可使同源性較高的同功能酶進行改組，大大提高基因突變率。

本課題組前期在E.coli JM109中（以pTrc99a為載體）分別單獨克隆表達 cadA、ldcC（來自于E.coli）和ldc（來自于H.alvei）3種典型賴氨酸脫羧酶基因，CadA和 LdcC的比酶活分別為1 652和1 329 U/mg；Ldc比酶活為2 366 U/mg（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。因此，本研究中，筆者選擇2個酶活較高的賴氨酸脫羧酶基因cadA和ldc作為研究對象，分別構建重組質粒pTrc99a-cadA和pTrc99a-ldc，以此2種質粒為模板，經PCR擴增，獲得基因片段，繼而利用DNA改組等體外分子定向進化技術，對賴氨酸脫羧酶基因ldc進行分子改良，以期獲得酶活力提高或酶學性質改善的優(yōu)良突變菌。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

H.alvei AS1.1009由天津北洋百川生物技術有限公司惠贈。E.coli JM109、質粒pTrc99a保存于筆者所在實驗室，含賴氨酸脫羧酶基因的重組質粒pTrc99a-cadA和pTrc99a-ldc由筆者所在課題組成員構建。

1.1.2 酶和試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶等，均購自TaKaRa公司。其他化學試劑為市售國產或進口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10。121℃濕熱滅菌30min。

固體鑒別培養(yǎng)基LBXL：在液體LB培養(yǎng)基的基礎上添加0.5%（質量分數(shù)）L-賴氨酸和0.01%（質量分數(shù)）溴甲酚紫，并添加終濃度為0.3 mmol/L的IPTG對重組質粒進行誘導表達，pH 6.0。

1.1.4 賴氨酸脫羧酶基因引物設計

根據(jù)E.coli JM109中賴氨酸脫羧酶基因cadA序列和H.alvei AS1.1009中賴氨酸脫羧酶基因ldc序列，使用Primer Premier5.0軟件輔助設計2個基因序列的上下游引物。分別在引物的5′端增加2～3個保護堿基（劃線字母），引入限制內切酶酶切位點（加粗斜體字母）BamHⅠ和HindⅢ，以便后期的克隆與表達。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

cadA-1：5′-CGGGATCCATGAACGTTATTGCAATATTG-3′；cadA-2：5′-CCCAAGCTTTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC-3′；ldc-1：5′-CGGGATCCATGAATATCATTGCCATCATGAACG-3′；ldc-2：5′-CCC AAGCTTTTATGACTTCTTCGCCGCTGAT-3′。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增cadA和ldc基因

分別以E.coli JM109和H.alvei AS1.1009的基因組DNA為模板，進行PCR反應。反應體系：模板DNA3μL、上游引物2μL、下游引物2μL、10×Buffer 5μL、MgCl2（2.5 mmol/L）4μL、dNTPs 4μL、rTaq DNA聚合酶0.5μL、加重蒸水至50μL。反應條件：95℃5min；95℃1min，58℃30 s，72℃ 3min，循環(huán)30次；72℃10min。

PCR結果用1.0%（質量分數(shù)）瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，之后用DNA回收試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技公司）回收純化PCR產物，并經過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切（37℃、2.5 h），分別連接到pTrc99a載體上，重組質粒 pTrc99a-cadA和pTrc99a-ldc利用 CaCl2轉化法轉化至大腸桿菌JM109，構建隨機突變體庫。

1.2.2 DNA改組

1）限制性內切酶法降解DNA及回收小片段以構建獲得的重組質粒pTrc99a-cadA和pTrc99aldc為模板，分別用限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ對2個重組質粒進行雙酶切，回收cadA和ldc基因片段。分別選擇限制性內切酶①XhoⅠ、②EcoRⅠ、③PstⅠ、④ClaⅠ對cadA基因片段進行酶切，⑤SacⅠ、⑥ClaⅠ、⑦PvuⅠ、⑧EcoRⅠ對ldc基因片段進行酶切［9］，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

2）無引物PCR 上步獲得的8種酶切片段分別兩兩組合作為模板進行一次無引物PCR，即①⑤、①⑥、①⑦、①⑧、②⑤、②⑥、②⑦、②⑧、③⑤、③⑥、③⑦、③⑧、④⑤、④⑥、④⑦和④⑧。反應體系：模板 DNA 3μL、10×Buffer 5μL、MgCl2（2.5 mmol/L）4μL、dNTPs 4μL、rTaq DNA聚合酶0.5μL、加重蒸水至50μL。反應條件：95℃2min；95℃30 s，58℃15 s，72℃ 2.5min，循環(huán)40次；72℃10min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳。再以上步無引物PCR產物混合為1管作為模板，進行2次無引物PCR（反應體系同上步），1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

3）有引物PCR 以上一步二次無引物PCR產物作為模板，進行有引物PCR，獲得大小正確的目的條帶，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。用DNA回收試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技公司）回收純化PCR產物，并經過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，分別連接到pTrc99a載體上，重組質粒pTrc99a-LDC利用CaCl2轉化法轉化至大腸桿菌JM109，構建隨機突變體庫。

1.2.3 高通量篩選

大量抽提突變文庫中重組質粒，CaCl2轉化法轉化至大腸桿菌JM109，涂布于LB抗性平板。溴甲酚紫是一種酸堿指示劑，其變色范圍是pH 5.2（黃色）～6.8（紫色）。1，5-戊二胺是一種具有生物活性的含氮堿，將 LB抗性平板上長出的菌落點于LBXL平板上，培養(yǎng)12 h，菌體產生的目的產物1，5-戊二胺會使得菌體周圍的LBXL培養(yǎng)基（黃綠色）變成紫色透明圈，觀察紫色透明圈大小，挑取透明圈比野生型大的32個突變株進行比酶活測定。測定上述兩輪突變體的酶活，進行進一步驗證。經第二輪進化后，獲得最佳突變體LDC2-16。

1.2.4 賴氨酸脫羧酶酶活力測定

酶活具體方法參照文獻［5，10-11］進行。

1.2.5 溫度和pH對賴氨酸脫羧酶活性的影響

在不同溫度（23、30、37、44和51℃）下測定酶活力，以未處理的野生型酶液活力為100%，計算各組酶的相對活力。在不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）緩沖液（50 mmol/L乙酸鈉）配制的50 g/L賴氨酸底物下，測定酶活力，以未處理的野生型酶液活力為100%，計算各組酶的相對活力。

1.2.6 賴氨酸脫羧酶的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

在pH6.0條件下，將酶液在不同的溫度（23、30、37、44和51℃）下保溫2 h，測定酶活力，以未處理的野生型酶液活力為100%，計算各組酶的相對活力。酶液與上述不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）緩沖液（50 mmol/L乙酸鈉）于30℃保溫2 h，測定酶活力，以未處理的野生型酶液活力為100%，計算各組酶的相對活力。

2 結果與討論

2.1 PCR擴增cadA和ldc基因結果

首先通過常規(guī)PCR擴增方法獲得了2個賴氨酸脫羧酶基因：cadA（2 142 bp，來自于 E.coli JM109）和ldc（2 199 bp，來自于H.alvei AS1.1009）的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳分析結果見圖1。查詢NCBI數(shù)據(jù)庫得知，2種基因的同源性為75%。膠回收試劑盒回收cadA和ldc基因片段的PCR產物，并經過BamHⅠ和 HindⅢ雙酶切、純化，連接到pTrc99a載體上，獲得重組質粒pTrc99a-cadA和pTrc99a-ldc。

2.2 DNA改組結果及鑒定

1）限制性內切酶法降解DNA及回收小片段結果 分別用限制性內切酶①XhoⅠ、②EcoRⅠ、③PstⅠ、④ClaⅠ對 cadA基因片段進行酶切，用⑤SacⅠ、⑥ClaⅠ、⑦PvuⅠ、⑧EcoRⅠ對ldc基因片段進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析，結果見圖2。

圖1 目的基因PCR擴增產物Fig.1 PCR amplification of the two target gene product

2）無引物PCR擴增結果 將由限制性內切酶獲得的DNA小片段分別兩兩組合作為模板進行一次無引物PCR，結果進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果見圖3。再以上步無引物PCR產物混合為1管作為模板，進行二次無引物PCR，瓊脂糖凝膠電泳分析，結果見圖4。

圖2 限制性內切酶酶切cadA和ldc基因片段Fig.2 The restrict enzyme digestion of cadA and ldc

圖3 一次無引物PCRFig.3 Primerless PCR for the first time

3）有引物PCR擴增結果 以上一步二次無引物PCR產物作為模板，進行有引物PCR，獲得大小正確的2 200 bp的目的條帶（圖5），瓊脂糖凝膠電泳。

2.3 DNA改組突變體庫構建

上述DNA改組產物克隆、連接到pTrc99a表達載體上，獲得重組質粒pTrc99a-LDC，利用CaCl2轉化法轉化至大腸桿菌JM109，構建了庫容約為5 000的初級突變體庫。PCR和雙酶切結果驗證重組pTrc99a-LDC構建成功（圖6）。

經過2輪DNA改組，改組結果較為成功。經過LBXL板初篩和高效液相色譜（HPLC）復篩，成功構建了賴氨酸脫羧酶突變體庫，建立了高通量篩選方法，共獲得了5 000多個突變體，獲得1株酶活性提高的賴氨酸脫羧酶突變體：LDC2-16，其比酶活測定為4 869.86 U/mg（以1 mg總蛋白計），與2種野生型賴氨酸脫羧酶CadA（1 652.63 U/mg）、Ldc（2 365.93 U/mg）相比，在最適溫度37℃、pH 6.0時，突變體的比酶活分別是上述野生型酶的2.95和2.06倍。搖瓶發(fā)酵5 h后，目標產物1，5-戊二胺產量從46.9 g/L達到了63.9 g/L，提高了36%。Takarashi等［12］利用E.coli JM109過表達cadA基因，通過補料、pH調控等操作，15 h后發(fā)酵產量達69 g/L；Martin等［13］以也以C.glutamicum作為1，5-戊二胺生產菌株進行實驗，整個過程經過發(fā)酵、pH調控、熱處理、萃取、蒸餾純化等步驟，80 h后1，5-戊二胺產量達到72 g/L，是目前研究報道中的最高生產水平。

圖4 二次無引物PCRFig.4 Primerless PCR for the second time

圖5 有引物PCRFig.5 PCR with primers

圖6 雙酶切鑒定重組質粒pTrc99a-LDCFig.6 Double digestion of recombinant plasmid pTrc99a-LDC

圖7 野生型酶CadA、Ldc和突變體的酶LDC2-16的最適溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.7 The optimal temperature and temperature stability of wild-type CadA，Ldc and mutant LDC2-16

2.4 野生型CadA、Ldc和突變體的酶LDC2-16的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

圖7為野生型 CadA和 Ldc和突變體的酶LDC2-16的最適溫度及其溫度穩(wěn)定性。由圖7（a）可知：野生型酶的最適溫度均為37℃，突變體的酶LDC2-16的最適溫度為30℃，同時突變體的酶在45℃時的相對酶活力依舊維持在80%～90%，而野生型酶在該溫度下活性已呈現(xiàn)下降趨勢。由圖7（b）可知：野生型酶在30～45℃穩(wěn)定性較好，突變體的酶在28～45℃穩(wěn)定性較好，但在相對較低的溫度下，野生型酶的穩(wěn)定性要稍差于突變體的酶。

2.5 野生型CadA、Ldc和突變體的酶LDC2-16的最適pH和pH穩(wěn)定性

圖8為野生型 CadA和 Ldc及突變體的酶LDC2-16的最適pH及pH穩(wěn)定性結果。由圖8（a）可知：野生型酶的最適pH均為7.0，突變體的酶LDC2-16的最適pH為6.0～7.0，pH范圍稍寬。由圖8（b）可知：在pH 8.0時，野生型酶活性迅速下降，突變體的酶相對酶活力還維持在50%～60%。無論是pH范圍還是pH穩(wěn)定性，突變體的酶都優(yōu)于野生型酶。

圖8 野生型酶CadA、Ldc和突變體的酶LDC2-16的最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.8 The optimal pH and pH stability of wild-type CadA，Ldc and mutant LDC2-16

3 結論

通過體外定向進化技術對賴氨酸脫羧酶進行了分子改造，獲得1株酶活性提高的賴氨酸脫羧酶突變體，編號為LDC2-16，其比酶活為4 869.86 U/mg（以1 mg總蛋白計），與2種野生型賴氨酸脫羧酶基因表達的酶 CadA（1 652.63 U/mg）、Ldc（2 365.93 U/mg）相比，在最適溫度37℃、pH 6.0時，突變體的比酶活分別是上述野生型酶的2.95和 2.06倍。搖瓶發(fā)酵5 h后，目標產物1，5-戊二胺產量從46.9提高至63.9 g/L，提高了36%。后續(xù)實驗可以利用基因測序、定點突變等方法來具體研究氨基酸突變點對此酶活的影響，進而為解釋其蛋白質結構與功能之間的關系奠定堅實的基礎。

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（責任編輯 荀志金）

Directed evolution by DNA shuffling of lysine decarboxylase gene cadA and ldc

ZHANG Kai，CAI Heng，WANG Chen
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Enginneering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

We enhanced the activity of two lysine decarboxylase（LDC）cadA and ldc by DNA shuffling through random mutation.One lysine decarboxylase gene cadA from Escherichia coli and the other ldc from Hafnia alvei AS1.1009 were linked into vector pTrc99a.Referring to NCBI database，the nucleotide sequence analysis showed 75%homology between cadA gene and ldc gene.Then，we obtained three recombinant plasmid pTrc99a-cadA and pTrc99a-ldc.As templates，two plasmids were amplified by normal PCR to obtain the genes cadA and ldc.According to the restriction enzyme sites present in the two genes，we used variety of restriction enzyme sites to get endonuclease fragments.Then，the random fragments were purified and reassembled by PCR without primers and the products were amplified by routine PCR.These fragments were successfully reassembled to genes of the same size as LDC.The activity of LDC2-16 can reach to 4 869.86 U/mg total protein，which is 2.95 and 2.06 times as that of the wide type（CadA 1 652.63 U/mg、Ldc 2 365.93 U/mg）under the optimum conditions oftemperature 37℃，pH 6.0.After 5 h fermentation，the target product 1，5-diaminopentane production researched 63.9 g/L from 46.9 g/L with an increase of 36%.

DNA shuffling；directed evolution；lysine decarboxylase；Hafnia alvei；Escherichia coli

Q93

A

1672-3678（2015）05-0020-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.004

2014-03-10

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CBA00807）

張 凱（1987—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，研究方向：基因工程和發(fā)酵工程；蔡 恒（聯(lián)系人），副教授，E-mail：cheng@njtech. edu.cn