豬PILRB基因的克隆及多態(tài)性分析

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豬PILRB基因的克隆及多態(tài)性分析

楊秀芹，邵思宇，李利族，王秋實，牛艷春，張姣

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：Ⅱ型配對免疫球蛋白樣受體（Paired immunoglobulin-like type 2 receptors，PILRs）是近年發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族成員之一，含有兩個亞型，PILRα和PILRβ。在機體天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，目前豬PILRB基因基因組序列尚未得到克隆、測序。研究利用PCR方法克隆豬PILRB基因部分基因組序列并分析該區(qū)域多態(tài)性。結(jié)果表明，獲得豬PILRB基因序列長1 127 bp，包含完整外顯子1、內(nèi)含子1、外顯子2、內(nèi)含子2、外顯子3和部分內(nèi)含子3。豬PILRB基因內(nèi)含子1和內(nèi)含子2為研究首次克隆，全長分別為9和314 bp。在該區(qū)域共檢測到15個SNPs，其中6個為中度多態(tài)位點，共形成5種單倍體型，ACACCG為優(yōu)勢單倍體型。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示這些SNPs對PILRβ功能的影響及其在豬抗病育種中的作用提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬；PILRB基因；克隆；SNPs

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-1-12 9:53:57

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150112.0953.012.html

楊秀芹,邵思宇,李利族,等.豬PILRB基因的克隆及多態(tài)性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(1): 68-73.

Ⅱ型配對免疫球蛋白樣受體（Paired immuno?globulin-like type 2 receptors，PILRs）是免疫球蛋白超家族成員之一，包括α和β兩個亞型。PILRα是免疫抑制性受體，PILRβ是免疫激活性受體，二者在胞外區(qū)高度同源，都含有一個免疫球蛋白樣V型結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與配體結(jié)合。在胞內(nèi)區(qū)，PILRα含有兩個酪氨酸殘基免疫受體抑制性基序（Immunore?ceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM），可釋放抑制性信號[1]；PILRβ胞內(nèi)區(qū)較短，不含有ITIM，能夠與含有酪氨酸殘基免疫受體激活性基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif , ITAM）的接頭分子相結(jié)合，釋放激活性信號[2]。

PILRα和PILRβ兩種受體通過傳遞重要的對立信號參與維持機體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)定，在宿主免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用[3]。PILRs還與病毒入侵、疾病發(fā)生有關(guān)。人I型單純皰疹病毒（Herpes simplex virus 1, HSV1）通過包膜糖蛋白B（Glycoprotein B, gB）與PILRα相互作用侵入宿主細(xì)胞，gB基因突變導(dǎo)致病毒無法以PILRα依賴的方式入侵，機體疾病癥狀減輕[4-5]。本文利用高通量測序技術(shù)在豬呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)篩選豬抗病毒候選基因時，發(fā)現(xiàn)有一個tag的表達(dá)受到病毒類似物——poly（I?C）顯著誘導(dǎo)，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該tag對應(yīng)于豬PILRB基因。

目前，GenBank上提供的豬PILRB基因序列尚不完整，有關(guān)豬PILRβ的研究尚未見報道。本研究以大白豬、民豬、北京黑豬為試驗材料，克隆豬PILRB基因的部分基因組序列；采用PCR產(chǎn)物直接測序方法在所擴增區(qū)域內(nèi)尋找SNPs，分析各SNPs在群體中的分布規(guī)律；并通過生物信息學(xué)方法預(yù)測SNPs對豬PILRβ配體識別、信號傳遞的影響，研究結(jié)果可為豬PILRβ功能的揭示提供序列基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物及基因組DNA提取

大白豬、民豬、北京黑豬均來自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所豬場。采集耳組織樣放在裝有75%酒精的EP管中，常溫帶回實驗室。采用酚-氯仿法提取基因組DNA。

1.1.2主要藥品及試劑盒

限制性內(nèi)切酶、rTaq酶、dNTPs、DNA Marker、pMD18-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒（小量）抽提試劑盒購自天根生物科技有限公司；膠回收（小量）試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖為西班牙原裝進(jìn)口；酵母提取物、胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司；氨芐青霉素試劑購自Amresco公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖實驗室保存。

1.2引物設(shè)計與合成

以GenBank中提供的豬PILRB mRNA序列（JQ890108.2）為探針，在UCSC數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blat，并參考人PILRB基因結(jié)構(gòu)，確定豬PILRB基因結(jié)構(gòu)及外顯子/內(nèi)含子邊界。利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物，擴增豬PILRB部分基因組序列。引物序列如下：

上游：5' GCAAGACTGATAAAGGAAGTGAC GG 3'；

下游：5' AAAAGCGGAAGGTTGGCGG 3'

上游引物位于起始密碼子上游198 bp處，下游引物位于內(nèi)含子3的144 bp處。

1.3 PILRB基因組序列的克隆

以北京黑豬基因組DNA為模板，利用所設(shè)計引物對PILRB基因進(jìn)行克隆。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，含有2.5 μL 10×PCR buffer，0.5 μL dNTPs （2.5 mmol·L-1each），上、下游引物各0.5 μL（10 pmol·L-1），rTaq酶0.25 μL，DNA 50 ng。PCR擴增條件：95℃5 min；94℃30 s，61.5℃30 s，72℃90 s，35個循環(huán)；72℃5 min。擴增產(chǎn)物膠回收純化后，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌落送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.4豬PILRB基因多態(tài)性分析

分別以大白豬（10頭）、民豬（13頭）每個個體基因組DNA為模板，擴增PILRB基因組序列，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，利用PCR產(chǎn)物直接測序方法尋找多態(tài)位點。

1.5數(shù)據(jù)分析

利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對和SNP位點查找，利用Chromas軟件肉眼觀察測序峰圖，確定SNP位點是否為雜合。利用Popgene軟件計算等位基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量（Polymorphism information content, PIC）等統(tǒng)計參數(shù)值；利用SHEsis在線軟件（http://analysis.bio-x. cn/myAnalysis.php）分析連鎖不平衡程度；利用PHASE V2.1軟件進(jìn)行單倍體型分析。

2　結(jié)果與分析

2.1豬PILRB基因組部分序列分析

利用設(shè)計引物獲得特異性較好的PCR產(chǎn)物，大小和理論預(yù)期一致（見圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序和序列拼接后，獲得1 127 bp序列，包括PIL?RB基因完整外顯子1、內(nèi)含子1、外顯子2、內(nèi)含子2和部分內(nèi)含子3序列（見圖2）。

圖1　豬PILRB基因組部分序列擴增結(jié)果Fig. 1　Amplification result of partial genomicsequence of PILRBgene in porcine

2.2豬PILRB基因多態(tài)性分析

采用PCR產(chǎn)物直接測序方法分析10頭大白豬、13頭民豬PILRB基因多態(tài)性，在所擴增區(qū)域共檢測到15個SNPs，為更好地解釋15個SNPs多態(tài)意義，對23頭豬的SNPs進(jìn)行多態(tài)信息含量統(tǒng)計，結(jié)果見表1。其中6個SNPs位點在試驗群體中多態(tài)信息含量呈中度多態(tài)（0.25

2.2.1 SNPs鑒定

采用PCR產(chǎn)物直接測序方法分析10頭大白豬、13頭民豬PILRB基因多態(tài)性，在所擴增區(qū)域共檢測到15個SNPs，其中3個位于5'調(diào)控區(qū)、5個位于內(nèi)含子2、7個位于編碼區(qū)（Coding sequences, CDS）。4個SNPs是錯義突變，導(dǎo)致多肽鏈氨基酸的改變（見表1）。

2.2.2基因型頻率/基因頻率分析

多態(tài)信息含量分析表明，-17A>G、I2-145C> A、I2-158A>G、c.198G>C、c.374C>T和c.445A>G為中度多態(tài)位點（0.25G位點，民豬和大白豬兩個群體的優(yōu)勢等位基因不同（見表2）。

圖2　豬PILRB基因組序列測序結(jié)果Fig. 2　Sequencing result of PILRB genomic sequence

表1　豬PILRB基因SNPs的相關(guān)信息Table 1　Information of SNPs in porcine PILRBgene

表2　中度多態(tài)位點的基因型頻率/等位基因頻率Table 2　Moderately polymorphic loci genotype /allele frequencies　(%)

2.2.3連鎖不平衡分析

利用SHEsis在線軟件對這6個中度多態(tài)位點進(jìn)行等位基因連鎖不平衡狀態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)c.198G> C、c.374C>T、c.445A>G為完全連鎖不平衡（D'= 1.000，r2=1.000）。-17A>G、I2-145C>A、I2-158A> G與c.198G>C、c.374C>T、c.445A>G這6個位點也達(dá)到有意義的連鎖不平衡（D'>0.679，r2>0.194）（見圖3，表3）。

圖3　豬PILRB基因6個位點連鎖不平衡系數(shù)D'、r2圖譜Fig. 3　Linkage disequilibrium coefficient D',r2map for six loci of porcine PILRB

表3　豬PILRB基因6個SNPs位點連鎖不平衡系數(shù)Table 3　Linkage disequilibrium coefficient forsix SNPs loci of porcine PILRB

2.2.4單倍體型分析

運用PHASE V2.1軟件對這6個位點進(jìn)行單倍體型分析，發(fā)現(xiàn)它們構(gòu)成5種單倍體型，其中ACACCG為優(yōu)勢單倍體型（見表4）。

表4　豬PILRB單倍體型分析Ta?ble 4 Haplotype combinations analysis of porcine PILRB gene

3　討論與結(jié)論

PILRs主要在髓系抗原遞呈細(xì)胞上表達(dá)，是受SHP-1磷酸化調(diào)控的含有酪氨酸殘基的成對受體蛋白，在免疫細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要作用。國內(nèi)外對鼠和人PILR基因研究發(fā)現(xiàn)其參與特異性和非特異性免疫應(yīng)答，并有多種變異剪接體存在。2012年，牛艷春等在豬上克隆得到PILRB基因cDNA序列，獲得豬PILRB基因4個變異剪接體[6]。牛艷春還采用RT-PCR定量技術(shù)構(gòu)建豬PIL?RB基因組織表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)PILRB基因在心臟、肝臟、脾臟、肺、肌肉、小腸、胃、腎臟8種組織中都表達(dá)，脾臟、胃和腎臟中表達(dá)量較高[6]。研究表明，在小鼠中PILRB基因在肺、肝臟和脾臟中表達(dá)量相對較高。脾臟是哺乳動物機體內(nèi)最主要的免疫器官，含有大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，是機體體液免疫和細(xì)胞免疫中心。研究結(jié)果暗示PILRB基因在機體免疫中發(fā)揮重要作用。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）指在染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起DNA序列的多態(tài)性，其中一種等位基因在群體中頻率不少于1%，SNP只包括堿基替換不包括堿基插入和缺失，在遺傳上比較穩(wěn)定[7-8]。SNP在大多數(shù)基因組中存在較高頻率，人類基因組中平均約1 kb就存在1個，SNP由于具有密度高、遺傳穩(wěn)定、分析易于自動化等特點，因此在遺傳育種領(lǐng)域中意義重大[9]。本研究采用分子生物學(xué)方法克隆得到豬PILRB基因部分基因組序列，首次獲得豬PILRB基因完整內(nèi)含子1、2和部分內(nèi)含子3序列；發(fā)現(xiàn)6個中度多態(tài)位點（0.25< PIC<0.5）。PIC是群體內(nèi)遺傳變異的量度，其值高低反映群體內(nèi)個體均勻度。數(shù)值高，遺傳變異就大，反之，則群體內(nèi)遺傳變異就小。認(rèn)為PIC<0.25為低度多態(tài)，0.250.5為高度多態(tài)。本研究在所擴增區(qū)域內(nèi)，檢測到6個中度多態(tài)位點，說明豬PILRB基因有著較豐富的多態(tài)性。

SNPs能夠改變受體蛋白的配體識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，對蛋白功能產(chǎn)生重要影響。草魚Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）3啟動子區(qū)的點突變（-764G>T）與其對呼吸道腸病毒的抗性顯著相關(guān)[10]，人TLR3胞外區(qū)的一個錯義突變（c.1234C>T; p. P412L）導(dǎo)致TLR3失去配體結(jié)合能力[11]。另有研究認(rèn)為免疫相關(guān)受體的配體識別區(qū)與病原微生物共同進(jìn)化，產(chǎn)生較多SNPs位點，以便更好監(jiān)測病原微生物入侵[11]。本研究在PILRB啟動子區(qū)和胞外區(qū)均檢測到點突變，SNPs -17A>G和c.374C>T發(fā)生的頻率較高，為通過細(xì)胞水平功能研究揭示其對基因表達(dá)、配體識別、信號傳遞的影響，為群體水平抗病相關(guān)遺傳標(biāo)記篩選與確定提供基礎(chǔ)。

本研究成功克隆豬PILRB基因內(nèi)含子1、2和部分內(nèi)含子3序列，采用PCR產(chǎn)物直接測序方法鑒定15個SNPs，并分析其中6個中度多態(tài)位點在群體中的分布規(guī)律、連鎖不平衡關(guān)系和單倍體型。研究結(jié)果可為進(jìn)一步揭示SNPs對蛋白功能影響提供基礎(chǔ)。

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Yang Xiuqin, Shao Siyu, Li Lizu, et al. Cloning and polymorphism analysis on porcine PILRB gene[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(1): 68-73. (in Chinese with English abstract)

Cloning and polymorphism analysis on porcine PILRB gene

/YANG Xiuqin,SHAO Siyu, LI Lizu, WANG Qiushi, NIU Yanchun, ZHANG Jiao

(School of Animal Sciences and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:Paired immunoglobulin-like type 2 receptors (PILRs) composed of two subtypes, PILRα and PILRβ, are members of immunoglobulin superfamily found recently. They play important roles in host innate immune responses. However, genomic sequence of porcine PILRB gene has not been cloned and sequenced as yet. This study was designed to clone and analyze polymorphisms of partial genomic sequences of porcine PILRB gene by using PCR method. The sequence obtained was 1 127 bp in length and contained the complete sequence of exon 1, intron 1, exon 2, intron 2, exon 3 and partial of intron 3. Intron 1 and intron 2 of porcine PILRB gene, 9 and 314 bp in length, respectively, were first identified experimently. Totally, 15 SNPs were identified in the region. Six SNPs were medium polymorphic loci and group into five haplotypes of which ACACCG was dominant haplotype. The results provide a basis for further analyzing the effect of these SNPs on protein function, and the role in disease-resistant breeding as well.

Key words:pig; PILRBgene; cloning; SNPs

作者簡介：楊秀芹（1971-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為豬分子遺傳與育種。E-mail: xiuqin163@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31072007）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12541014）

收稿日期：2014-10-16

文章編號：1005-9369（2015）01-0068-06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號：S858.28；Q785